紫檀芪通過PI3K-AKT信號途徑抑制缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡

劉 峰 董少紅吳美善 梁瑞娟 熊 瑋 劉華東 陳科奇 林 峰

深圳市人民醫院心內科，廣東深圳 518100

紫檀芪通過PI3K-AKT信號途徑抑制缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡

劉 峰 董少紅▲吳美善 梁瑞娟 熊 瑋 劉華東 陳科奇 林 峰

深圳市人民醫院心內科，廣東深圳 518100

目的探討紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的影響，以及對磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路的影響。方法乳鼠心肌細胞經過缺氧/復氧（H/R）處理，再模擬心肌缺血再灌注損傷。實驗分為正常組，模型組（H/R），紫檀芪組（H/R+0.5，5，50μmol/L紫檀芪）。MTT法檢測各組心肌細胞活力；倒置顯微鏡拍照檢測各組心肌細胞形態；Annexin V-FITC/PI 流式雙染法檢測各組心肌細胞凋亡； Western blot分析PI3K/AKT激活狀況。結果與正常組比較，模型組中心肌細胞皺縮，變圓變亮，細胞活力降低，細胞早期凋亡和晚期凋亡率顯著提高，PI3K表達量及AKT磷酸化程度降低，差異均具有顯著性（P＜0.05）；與模型組比較，5，50μmol/L紫檀芪組中心肌形態恢復，細胞活力上升，PI3K表達量提高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；0.5，5，50μmol/L紫檀芪組心肌細胞凋亡程度下降，AKT磷酸化水平上升，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。結論紫檀芪可抵抗缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，PI3K/AKT信號被激活是其作用表達的主要方式。

紫檀芪；乳鼠心肌細胞；缺氧/復氧；細胞凋亡

細胞凋亡是缺血性心肌損傷的重要表現之一，要使心臟功能得到改善，始終保護缺血/心臟再灌注，心肌細胞減少凋亡數量等，需要激活PI3K-Akt通路[1-3]。紫檀芪Pterostilbene （Pte）具有抗真菌、抗細胞增殖，預防氧化應激反應、抗炎、降血脂等作用，可改善缺血再灌注損傷[4-5]。心肌細胞凋亡（尤其是缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡）與紫檀芪相關的研究數據較少，因此進行了本次研究，闡明Pte對心肌IR損傷的作用（保護作用及可能機制作用），為更好的治療心肌IR損傷提供了可行的重要依據。

1 資料與方法

1.1 材料

南方醫科大學生化實驗室提供了本次研究的所有材料與實驗儀器。Wistar乳鼠（出生12d）100只，雌雄不做限制。美國Gibco公司提供本次實驗所需胰蛋白酶及胰脫氧核糖核酸酶，杭州四季青生物工程材料有限公司提供本次實驗的胎牛血及四甲基偶氮唑鹽（ MTT）。中國海克隆生物公司提供本次實驗的DMEM培養基。瑞士羅氏公司提供本次實驗的青霉素及鏈霉素。抗AKT，p-AKT，PI3K，GADPH單克隆抗體購自購于美國Santncruz公司。紫檀芪，購于日本富士株式會社。本次研究進行前，已經被動物研究委員會準許，研究過程中所選擇的動物都受到了人道待遇（依照美國衛生部頒布的《實驗動物使用和關愛指南》，NIH頒布86-23，1986年修訂）批。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞分離培養 新生乳鼠心肌細胞的分離培養參考已有的文獻記載。具體措施為，單個細胞被從Wistar乳鼠（出生12d）的心肌碎片（1～2mm3）中分離出來，分離環境為4℃，應用材料為胰蛋白酶（0.06%），在室溫37℃下進行消化（應用膠原酶）45min。之后在同樣室溫下進行培養1h，培養液為DMEM液[成分為氟脫氧鳥苷、HEPES、胎牛血清FBS、青霉素、鏈霉素，劑量（濃度）分別為2μmol/L、15mmol/L、5%、100U/mL、100mg/mL]，培養結果為使非心肌細胞貼壁。細胞培養瓶里（25cm2）存放上清中心肌細胞懸液，培養瓶密度在1×105細胞數/ cm2。培養環境為37℃，濕度為5%CO2恒定，培養液應用10%FBS的DMEM培養液，進行3d的培養。

1.2.2 缺氧復氧損傷模型（H/R）的建立及分組 缺氧復氧損傷模型（H/R）的建立是對缺氧溶液與復氧溶液的制備，并且制備過程中應用Koyama等。缺氧為原代乳鼠心肌細胞的正常培養液被缺氧液置替換，并被封閉20min；復氧為缺氧液又被復氧液替換，并進行15min的培養。分為5組，各（20只）：A組：正常對照組（Control）；B組： H/R組；C組：H/R+LPte組；D組：H/R+MPte組； E組： H/R+HPte組。

1.2.3 MTT法（細胞活力檢測） 細胞濃度進行調整（在乳鼠心肌細胞處于生長對數期被消化之后），96孔板進行細胞接種，給藥方法按照分組情況進行1d的培養，將培養結果倒置在纖維鏡下進行觀察并拍照，最后進行OD值測定[4h培養（每個孔板加MTT（ 5mg/mL） 20L），將上清去除，再進行10min培養（每個孔板加DMSO 150 L）]。

1.2.4 流式細胞儀檢測方法 培養皿（35mm）接種上4×105個細胞（每孔含量），并將個細胞進行消化和離心，選擇3個不同時間點（24，48，60h）進行細胞收集。常規消化，PBS洗滌，離心5min，收集細胞； 進行室溫下避光反應（5～15min），反應溶液按順序加入Binding Buffer 500L 懸浮細胞、Annexin V-FITC 5L、與PI 5L混勻，應用流式細胞儀檢測1小時內的細胞凋亡數量。

1.2.5 Westernblot檢測 消化心肌細胞（處于生長對數期的乳鼠），調整細胞濃（8×103個細胞/ mL），每孔1×104個心肌細胞接種于96孔板，每組3個復孔，繼續培養48h后收集細胞。收集細胞樣本，預冷PBS洗3次，蛋白提取采用的方法為細胞裂解法，上樣緩沖液被加在相同含量蛋白中，使每組蛋白上樣量均為30μg，蛋白電泳在凝膠中進行（4%～12% SDS-PAGE），最終聚偏氟乙烯膜PVDF上會有蛋白轉移過來，封閉2h的TBS-T緩沖液（5%脫脂奶中），在4℃環境下過夜（分別加入抗Bcl-2，抗Bax，抗Akt，抗Caspase-9和抗α-actin抗體），膜進行3遍清洗后與辣根過氧化物酶聯合的二抗（1：2000）孵育1h。Quantity One軟件測定灰度值進行半定量分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件。本次研究中的所有實驗至少重復3次，計量資料以（）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞形態及活力的影響

如圖1表示，與A組比較，B組中心肌細胞皺縮，細胞變圓變亮； 與B組相比，加入Pte組中的細胞形態恢復。如圖2表示，與A組比較，B組中心肌細胞活力下降，具有顯著性差異（P＜0.05）； 與B組比較，添加Pte組的細胞活力改善，差異具有統計學意義（P＜0.05），抑制高糖誘導的細胞形態異常及活力下降是Pte的顯著特點；同時觀察到Pte可劑量依賴性提高乳鼠心肌細胞H/R后的生存率。

2.2 紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的影響

圖1 紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞形態的影響

圖2 紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞活力的影響

各組組內比較結果：早期凋亡與晚期凋亡之間結果差異具有統計學意義（P＜0.05）；組間比較結果（表1）：與Control組（A組）對比，B組顯著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌細胞數量，并且差異具有統計學意義（P＜0.05）； 與H/R組比較，各個濃度紫檀芪組的乳鼠心肌細胞數減少（早期凋亡和晚期凋亡細胞數），差異具有統計學意義（P＜0.05）。表1中t、P值為組間比較。

表1 紫檀芪影響缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的情況分析（）

表1 紫檀芪影響缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的情況分析（）

注：與Control組比較，▲P＜0.05；與H/R組比較，★P＜0.05，◆P＜0.05

?組別 早期凋亡（%）晚期凋亡（ %） t P Control 0.5±0.2 2.8±0.2 36.4 ＜0.05 H/R 8.9±0.4▲ 34.2±3.1▲ 36.2 ＜0.05 H/R+LPte 8.1±1.3★ 26.4±2.6★ 28.2 ＜0.05 H/R+MPte 6.9±0.6◆ 15.2±1.7◆ 20.6 ＜0.05 H/R+HPte 3.7±0.3◆ 9.5±0.6◆ 38.7 ＜0.05

2.3 紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞中PI3K/AKT信號通路的影響

與Control組[P13K表達值為（2.2±1.2），AKT磷酸化水平為（0.8±0.1）]比較，H/R組中PI3K表達值為（0.4±0.1）及AKT磷酸化水平為（0.3±0.1），有所降低，具有顯著性差異（P＜0.05）； 與H/R組比較，H/R+LPte組PI3K表達值為（0.5±0.1），AKT磷酸化水平為（0.4±0.1）；H/R+MPte組PI3K表達值為（1.2±0.2），AKT磷酸化水平為（0.7±0.1）；E：H/R+HPte組PI3K表達值為（1.4±0.2），AKT磷酸化水平為（1.5±0.3）；各個濃度紫檀芪組PI3K表達量顯著提高，具有顯著性差異（P＜0.05）；各個濃度紫檀芪組AKT 磷酸化水平顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 紫檀芪對缺氧/復氧誘導乳鼠心肌細胞中PI3K/AKT信號通路的影響

表2 各組P13K表達與AKT磷酸化水平

3 討論

氧自由基增加，炎性因子浸潤，鈣離子超載，細胞凋亡等是缺血再灌注損傷發生的重要影響因素，多條凋亡途徑會造成缺血再灌注損傷（PI3K/AKT、酪氨酸激酶-信號轉導子、轉錄激活子JAK-STAT等）[6-7]。PI3K/AKT信號通路具有關鍵作用（在心肌IR損傷中），PI3K/AKT信號通路被激活可能是由于心肌IR引起而導致。AKT的上游激酶為PI3K，磷酸化形式的PI3K蛋白可以反映PI3K/AKT信號通路的活性[8-9]。本次研究表明，p-AKT在模型組中的水平較高，表示IR時PI3K/AKT信號通路被激活，紫檀芪給予后該蛋白的磷酸化形式被進一步提升，表示紫檀芪主要分子作用靶點可能是PI3K/AKT信號通路，通過激活PI3K/AKT信號通路發揮心肌保護效果，紫檀芪促進心肌細胞的增殖存活，同時一氧化氮合成酶eNOS在PI3K/AKT下游靶點被激活，釋放一氧化氮NO，從而起到擴張血管改善微循環的作用，進而起到心肌保護作用，但其具體的機制還需進一步探索[10-11]。而對于IR時PI3K/AKT通路本身處于激活狀態可能與反饋機制有關[12]。本研究證實紫檀芪能夠促進PI3K/AKT信號蛋白的表達減輕心肌損傷，對心肌缺血再灌注起著保護效應。然而在活體動物中，紫檀芪控制著極其復雜的相關信號通路機制[13-16]，對于紫檀芪在PI3K/AKT的變化及缺血再灌注心肌損傷的影響，需要做進一步的研究探索。

本次研究紫檀芪對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的影響，同時對磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路的影響進行了分析，選取100只Wistar乳鼠（出生12天）進行實驗研究，結果顯示：以缺氧復氧損傷B組和控制組A組為對照，C、D、E組乳鼠心肌細胞活力與兩組比較有顯著差異，P＜0.05；與A組比較B組顯著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌細胞數量，并且差異具有統計學意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的不同濃度紫檀芪的乳鼠心肌細胞數減少（早期凋亡和晚期凋亡細胞數），差異具有統計學意義（P＜0.05）；與A組比較，B組中PI3K表達及AKT磷酸化程度降低，差異具有顯著性差異（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的不同濃度紫檀芪的PI3K表達量顯著提高，差異具有顯著性差異（P＜0.05）；C、D、E組的不同濃度紫檀芪的AKT 磷酸化水平顯著提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。

紫檀芪對乳鼠心肌細胞凋亡（在缺氧/復氧誘導下）有抑制作用，并能有效提高細胞活力、改善細胞形態、同時激活PI3K/AKT信號通路。

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Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation through the PI3K-AKT signal pathway

LIU Feng DONG Shaohong WU Meishan LIANG Ruijuan XIONG Wei LIU Huadong CHEN Keqi LIN Feng
Department of Internal Medicine-Cardiovascular,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518100,China

ObjectiveTo investigate the effect of Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation and the effect of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / protein kinase B (AKT) signaling pathway.MethodsCardiomyocytes of neonatal rats were subjected to hypoxia / reoxygenation (H / R), and the hearts were subjected to myocardial ischemia-reperfusion injury. The rats were divided into normal group, model group (H / R) and pterocarpus stilbene group (H/R+0.5,5,50μmol/L).Cell viability was measured by MTT assay. Cardiomyocyte morphology was detected by inverted microscope. Annexin V-FITC / PI flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes.PI3K/AKT activation was analyzed by Western blot.ResultsCompared with the normal group, the center of model group of muscle cell was shrinkage, rounding and brightening, and the cell viability decreased, early and late apoptosis rate of cells increased significantly. The expression of PI3K and the phosphorylation of AKT in the model group were significantly higher than those in the model group (P＜ 0.05). Compared with the model group, 5, 50mol/L of pterostilbene group center muscle morphological was recovery, cell viability was increased, and the rosewood the expression of PI3K was increased, and the difference was significant (P＜0.05). 0.5,5,50 mol/L pterostilbene group the apoptosis of myocardial cells decreased, the phosphorylation level of AKT increased, the difference was significant (P＜ 0.05).ConclusionPterocarpus can resist cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia / reoxygenation, and activation of PI3K / AKT signal is the main way of its expression.

Pterocarpus stilbene;Neonatal rat cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation;Cell apoptosis

R285.6

A

2095-0616（2016）21-38-04

2016-09-06）

廣東省深圳市博士創新項目（201605004）。

▲通訊作者