枸杞多糖對人外周血巨噬細胞活性的影響

許忠新，單鐵英，蘇安英，楊書良

（河北工程大學醫學院：1.人體解剖學與組織胚胎學系；2.病理學系，邯鄲056002）

枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBP）是傳統中藥材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成。有研究證明，多糖成分（如云菇多糖、靈芝多糖等）可通過激活機體免疫系統來達到抗腫瘤目的［1－5］。對于LBP抑制腫瘤的免疫調節作用及免疫機制尚不十分清楚。本文主要以LBP為材料研究其對人外周血巨噬細胞免疫調節作用，為進一步開發免疫增強劑的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 健康人外周血采自20～30歲健康志愿者。人肝癌細胞株Bel－7402由作者提供。LBP由本校實驗中心從寧夏優質枸杞子中分離提取。人重組白介素－2（rIL－2）購自美國Peprotech公司。RPMI－1640為Gibco公司產品。MTT試劑均為Sigma公司產品。腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、ELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。淋巴細胞分離液為上海生化試劑二廠產品。胎牛血清（FBS）為杭州四季青公司產品。

1.2分離人外周血單核細胞（PBMC）無菌采取健康人外周血約5mL，予肝素抗凝，加入等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，用淋巴細胞分離液經密度梯度離心法分離外周血PBMC［6］，取白細胞層用PBS洗滌2次，加入含10%FBS的RPMI－1640培養基，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養2h，貼壁細胞作為巨噬細胞。

1.3分析巨噬細胞吞噬作用和測定細胞因子分泌 將培養的巨噬細胞用RPMI－1640培養基調整細胞濃度為2.5×106個/mL，接種于96孔培養板中，每孔80μL，實驗孔分別加入20 μL對照劑（培養基及20μg/mL rIL－2）和不同濃度（50、60、80、100μg/mL）LBP，培養24h后分別加入Bel－7402細胞懸液（1×105個/mL）100μL，使效、靶比為20∶1。每孔液體終體積為200μL，不足者用培養基補齊，每組均設4個復孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養48h后進行如下處理：（1）取各組培養上清液100μL，用ELISA測定TNF－α水平；（2）各孔加 MTT（5mg/mL）20μL，培養過夜，離心棄去培養上清液，每孔加入DMSO 150μL，混勻后以測定波長為492nm、參比波長為620nm檢測各孔A值，并計算對腫瘤細胞的抑制率。抑制率＝［1－（腫瘤細胞與巨噬細胞混合孔A值－巨噬細胞孔A值）/腫瘤細胞孔A值］×100%。

1.4統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析和LSD，實驗結果以s表示。

2 結 果

2.1LBP對人外周血巨噬細胞吞噬作用的影響 經不同濃度LBP作用72h后巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用明顯增強（P＜0.01），80、100μg/mL LBP刺激后巨噬細胞的吞噬作用明顯大于rIL－2組（P＜0.01），見表1。

表1 LBP對人外周血巨噬細胞吞噬作用的影響（n＝4）

2.2LBP對人外周血巨噬細胞TNF－α的影響 經不同濃度LBP作用72h后LBP組腫瘤細胞與巨噬細胞培養上清液中TNF－α水平明顯增高（P＜0.01），80、100μg/mL LBP組腫瘤細胞與巨噬細胞培養上清液中TNF－α量與對照組比較明顯增高（P＜0.01），但80、100μg/mL LBP組與rIL－2組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 LBP對人外周血巨噬細胞TNF－α的影響（n＝6）。

3 討 論

腫瘤患者在接受放、化療時射線和藥物對機體的免疫系統有抑制作用，致使機體免疫功能進一步下降，影響了治療效果并可導致一些不良反應，所以解決腫瘤患者免疫功能低下問題成為腫瘤治療的非常關鍵的環節。最近國內外學者提出生物反應調節劑（biological responsemodifier，BRM）的概念，強調在腫瘤放、化療及手術治療同時應用BRM，不但能提高患者免疫功能，還可減輕上述治療對免疫系統及造血系統的損害，從而提高治療效果。在我國，中藥取自天然，來源廣泛，容易獲得，不良反應小，因此從中藥中提取有效成分作為BRM顯示出明顯優勢。LBP具有很好的免疫促進作用，為進一步研究其作用機制，本文研究了LBP對外周血巨噬細胞增殖及功能的影響。

TNF－α能夠直接殺死病毒和腫瘤，最近文獻指出，TNF－α在CD8＋T細胞的成熟階段發揮重要的信號作用，TNF－α缺乏時會導致效應性CD8＋T細胞產生下降，影響其轉化為記憶性T細胞［7］。可見TNF－α除了對腫瘤細胞具有直接毒性和生長抑制作用外，還可以通過增強CD8＋T細胞的細胞毒作用抵抗腫瘤生長。

本研究結果顯示，在50～100μg/mL濃度下LBP可明顯提高巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷功能，并增強巨噬細胞TNF－α的分泌。提示LBP除可以直接增強巨噬細胞吞噬功能外，還可能通過促進巨噬細胞分泌TNF－α來間接殺傷腫瘤細胞。

本研究結果證實，LBP能夠增強巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷功能。LBP可作為BRM發揮免疫調節功能而增強抗腫瘤作用，但其具體的作用機制尚需進一步研究證實。

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