SUMO－1mRNA診斷肝癌的價值研究＊

郭武華，袁麗華，肖志華，羅良平，余 婷，張吉翔△

（南昌大學第二附屬醫院／江西省分子生物重點實驗室：1.腫瘤科；2.消化科 330006）

SUMO－1基因是 SUMO（small ubiquitin－like modifier）基因家族中的一員，主要參與蛋白質翻譯后功能的修飾，在轉錄、DNA修復、核質物質轉運及染色體分離等方面發揮重要作用［1－2］?，F已發現，SUMO－1的修飾調節了許多與癌癥發生、發展及轉移有關的蛋白的功能，如p53、增殖細胞核抗原、雌激素受體、端粒酶等［3－7］，提示 SUMO－1基因與癌癥發生、發展密切相關。作者前期研究發現，SUMO－1基因在肝癌細胞株SMMC－7721、HepG2、Hep3B以及臨床肝癌標本中均明顯高表達，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達較低［8］。本實驗通過檢測臨床肝癌、肝血管瘤及肝局灶性結節性增生標本中SUMO－1mRNA表達水平，以進一步評價SUMO－1基因診斷肝癌的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 肝癌、癌旁肝組織、肝血管瘤及肝局灶性結節性增生標本均來自本院外科2007年11月至2008年12月行肝切除患者，均經術后病理檢查確診。共檢測20例，其中男16例，女4例。肝細胞性肝癌術前甲胎蛋白（AFP）＜8.0 ng／mL（本院正常值上限）4例，肝細胞性肝癌術前AFP＞400 ng／mL 4例；肝內膽管細胞癌4例，肝血管瘤7例，肝局灶性結節性增生1例。

1.2 儀器設備 PCR熱循環儀（GeneAmp?PCR System 9600）及Gene Genius Match（syngene）全自動凝膠成像分析系統。

1.3 主要試劑 RNA 提取試劑 Trizol（Invitrogen）、RT－PCR試劑、Oligo（dT，Promega）、M－mLV RT 5×buffer（Promega）、dNTP（Generay Biotech）、Rnase抑制劑（Promega）、M－mLV 逆轉錄酶（Promega）、Master Mix（2×Taq PCR，Tiangen）、DNA ladder（Tiangen）等。

1.4 PCR引物 從http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov的 Gen－Bank中獲得人SUMO－1、β－actin基因序列，應用 Primer Primier5.0軟件設計引物，由Generay Biotech公司合成（表1）。

1.5 RT－PCR檢測SUMO－1mRNA表達 采用 Trizol提取肝癌及癌旁肝組織總RNA，合成cDNA。用PCR擴增每個標本中SUMO－1基因的表達，以β－actin作為內參照。SUMO－1 PCR通過94℃預變性5min，然后94℃、35s，51℃、35s，72℃、35s30個循環，72℃延遲延伸7min。β－actin PCR通過94℃預變性5min，然后94℃、35s，54℃、35s，72℃、35s 30個循環，72℃延遲延伸7min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5μg／mL溴化乙錠），在紫外線燈下觀察結果，通過Gene Genius Match全自動凝膠成像分析系統測條帶灰度值。各標本SUMO－1mRNA表達量為SUMO－1密度值與各自β－actin灰度值的比值。

表1 PCR反應引物

2 結 果

2.1 SUMO－1mRNA在肝癌中明顯高表達，而在癌旁肝組織中表達較低（圖1～3）。12例肝癌標本中SUMO－1表達量為0.513±0.065，而癌旁肝組織中 SUMO－1表達量為0.05±0.03，兩組SUMO－1mRNA表達水平差異有統計學意義（P＝0.009）。

圖1 AFP＞400ng／mL肝細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

圖2 AFP＜8ng／mL肝細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

圖3 肝膽管細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1 mRNA表達水平

2.2 AFP＞400ng／mL肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mR－NA表達水平與AFP＜8.0ng／mL肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平相近（圖1、2），SUMO－1表達量分別為0.51±0.08、0.45±0.05，差異無統計學意義（P＝0.426）。

2.3 在肝血管瘤及肝局灶性結節性增生標本中SUMO－1 mRNA 表達水平很低（圖4），SUMO－1表達量為 0.079±0.031，與肝癌標本比較，差異有統計學意義（P＝0.046）。

圖4 肝血管瘤、肝局灶性結節性增生及病灶旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

3 討 論

SUMO是泛素樣蛋白家族中的一員，與泛素不同，SUMO與底物蛋白結合后不引起蛋白降解，而是調節蛋白功能［9］。越來越多的蛋白被發現存在SUMO的修飾，這些蛋白的功能離不開SUMO的調節作用。SUMO家族蛋白在進化中高度保守，在脊椎動物中SUMO家族蛋白包括SUMO－1～4，SUMO－1廣泛參與人類癌癥相關蛋白功能的調節，促進癌癥的發生、發展［3－7］。因此SUMO－1與癌癥發生、發展關系密切，是癌癥發生、發展的一個重要的調節因子。

肝癌是常見惡性肝腫瘤之一，由于起病隱匿、進展迅速，治療效果較差?，F今診斷肝癌的手段除臨床表現及體征外，影像學技術特別是CT、MRI的進步在肝癌診斷中發揮不可或缺的重要作用。AFP是部分肝細胞性肝癌分泌的蛋白質，是診斷肝細胞性肝癌的一個重要的參考指標。我國頒布的肝細胞性肝癌的臨床診斷標準中，AFP具有重要的確診價值。AFP＞400ng／mL加上有肝癌特征的影像學檢查，即可確診為肝癌。AFP是我國診斷肝癌的重要參考指標，但不同的肝癌患者其血清AFP水平明顯不同，有些肝細胞性肝癌患者外周血AFP在正常值范圍，因此尋找一種廣泛存在于肝癌中能夠協助診斷肝癌的標志物具有重要意義。

有研究發現，在mRNA及蛋白水平SUMO－1基因在肝癌標本中均明顯高表達，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達較低［8］。通過RNAi方法，抑制肝癌細胞株SMMC－7721中SUMO－1的表達，可明顯抑制 SMMC－7721的生長［10］，提示 SUMO－1與肝癌發展關系密切。本研究采用RT－PCR方法，檢測肝癌、癌旁肝組織及肝良性腫瘤中SUMO－1mRNA表達水平，并與臨床常用的肝細胞性肝癌標志物AFP對比研究SUMO－1 mRNA診斷肝癌的應用價值。結果顯示，在肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平明顯高于癌旁肝組織，也明顯高于肝血管瘤及肝局灶性結節性增生標本。盡管在不同肝細胞性肝癌患者血清中存在AFP量的差異，但在不同肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA均明顯高表達，不同AFP水平患者肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平無明顯差異，因此鑒于在所有肝癌標本中均有SUMO－1mRNA高表達，SUMO－1 mRNA可成為診斷肝癌的一個有價值的指標。

［1］ Di Bacco A，Ouyang J，Lee HY，et al.The SUMO－specific protease SENP5is required for cell di－vision［J］.Mol Cell Biol，2006，26（12）：4489.

［2］ Martin S，Nishimune A，Mellor JR，et al.SUMO ylation regulates kainate－receptor－mediated synaptic transmission［J］.Nature，2007，447（7142）：321.

［3］ Buschmann T，Fuchs SY，Lee CG，et al.SUMO－1modification of Mdm2prevents its self－ubiquitination and increases Mdm2ability to ubiquitinate p53［J］.Cell，2000，101（7）：753.

［4］ Carter S，Bischof O，Dejean A，et al.C－terminal modifications regulate MDM2dissociation and nuclear export of p53［J］.Nat Cell Biol，2007，9（4）：428.

［5］ Pfander B，Moldovan GL，Sacher M，et al.SUMO－modified PCNA recruits Srs2to prevent recombination during S phase［J］.Nature，2005，436（7049）：428.

［6］ Karamouzis MV，Konstantinopoulos PA，Badra FA，et al.SUMO and estrogen receptors in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，107（2）：195.

［7］ Xhemalce B，Riising EM，Baumann P，et al.Role of SUMO in the dynamics of telomere maintenance in fission yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（3）：893.

［8］ 郭武華，袁麗華，肖志華，等.SUMO－1基因在肝癌中的表達及意義［J］.重慶醫學，2009，38（24）：2308.

［9］ Ulrich HD.Mutual interactions between the SUMO and ubiquitin systems：aplea of no contest［J］.Trends Cell Biol，2005，15（10）：525.

［10］郭武華，袁麗華，肖志華，等.SUMO－1基因siRNA抑制肝癌細胞SMMC－7721生長的研究［J］.天津醫藥，2010，38（1）：4.