南極磷蝦抗凍蛋白的特異性親和吸附提取研究

馬慶保,陳雪忠,劉志東,*,曲映紅,汪一紅,王 帥

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090; 2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

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南極磷蝦抗凍蛋白的特異性親和吸附提取研究

馬慶保1,2,陳雪忠1,劉志東1,*,曲映紅2,汪一紅1,王 帥1,2

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090; 2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

本文以南極磷蝦蛋白為原料,以南極磷蝦抗凍蛋白(Antifreeze proteins,AFPs)的得率為指標,開展了特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFPs的工藝研究。本文在單因素實驗的基礎上,通過響應面優化實驗研究樣品濃度、吸附溫度、吸附時間、吸附次數對南極磷蝦AFPs得率和熱滯活性(Thermal Hytersis Activity,THA)的影響。結果表明,南極磷蝦AFPs的最優提取條件為:樣品濃度1.0 mg/mL、吸附溫度-1.70 ℃、吸附時間為11 h、吸附次數為2次。在上述條件下預測南極磷蝦AFPs的得率為29.34%,THA為0.0805 ℃;驗證值與預測值之間的誤差分別為2.66%和1.86%。這表明該模型可以用于預測南極磷蝦AFPs的提取優化。本文的研究結果為南極磷蝦AFPs的深入研究提供技術支撐。

南極磷蝦,抗凍蛋白,特異性親和吸附,響應面法,優化

抗凍蛋白(Antifreeze proteins,AFPs)是一類可以非依數性地降低體系的冰點、改變冰晶形態、抑制冰晶生長的特殊蛋白質,亦稱熱滯蛋白(Thermal hysteresis proteins,THPs)、冰結合蛋白(Ice binding proteins,IBPs)或冰結構蛋白(Ice structuring proteins,ISPs)[1]。AFPs是生物體抵御低溫脅迫所產生的一類物質[2]。1969年,A.L.DeVries在南極魚(Trematomus borchgrevinki)的血液中發現了AFPs的存在[3]。隨后,不同物種來源的AFPs相繼被發現。

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是一種生活在南極海域的小型浮游類海洋動物,生物資源量巨大,目前處于尚未充分開發利用的狀態,具有良好的開發應用前景[4-5]。由于南極磷蝦生活于寒涼的南極海域(水溫約為-1.9 ℃)[6],為了適應南極海域嚴苛的低溫環境,南極磷蝦適應性地產生了抗凍活性物質(課題組已在前期研究中發現了南極磷蝦AFPs的存在)。由于AFPs良好的熱滯活性和冰晶生長抑制特性,其在冷凍食品、器官移植等領域具有廣泛的應用潛力[7]。目前,商業化應用的抗凍劑存在副作用大,價格較高,來源受限等問題。目前,植物來源,魚類及陸地動物來源的AFPs研究較多,如小麥,豬皮、沙冬青等。由于受原料來源、提取條件等因素的限制,商業化的天然來源抗凍劑還較少[8]。因此,開發來源廣泛、價格低廉,安全性高的天然抗凍劑具有非常迫切的需求。

AFPs的分離純化方法主要包括層析分離法、電泳分離法、濁點萃取法、真空滲透離心法等[9-11]。研究發現,上述 AFPs分離純化方法存在分離純化過程復雜、目標產物得率較低,目標產物活性易丟失等問題[12]。目前,AFPs的分離純化方法還僅限于實驗室規模。因此,基于AFPs的特異性探索新的AFPs分離純化方法已經成為AFPs研究的關鍵之一,尤其是具有高度專一性和選擇性的親和分離方法、材料的開發尤為重要。研究發現,特異性親和吸附法具有提取效率高,目標產物的結構和活性改變小的特點[13-14]。本文在前期工作的基礎上,搭建了特異性親和吸附裝置,以南極磷蝦AFPs得率和THA為響應值,確定了特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFPs的最佳條件,期望為南極磷蝦AFPs的利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 由上海開創遠洋漁業有限公司2014年11月于南極設得蘭群島海域捕獲,冷藏運回國內,實驗室于-80 ℃貯藏備用;所用試劑均為分析純及以上級別。

PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;TGl-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;BM255C攪拌機 美的集團有限公司;電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;90-2型定時恒溫磁力攪拌器 上海市滬西分析儀器有限公司;IMS-70型低溫恒溫槽 寧波天恒儀器廠;UV-2102PCS型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯分析儀器有限公司;真空冷凍干燥機 LABCONCO FreeZone公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白質的制備 參考高飛等[15]方法提取南極磷蝦蛋白質。

冷凍南極磷蝦→室溫解凍→勻漿→調節pH→離心→回收上清液→調節pH→離心→回收沉淀→調節pH至7.0→真空冷凍干燥→南極磷蝦蛋白質(-80 ℃貯存)。

1.2.2 南極磷蝦AFPs的提取及得率的計算 以南極磷蝦蛋白質為原料提取南極磷蝦AFPs,參照Kuiper等[13]方法構建特異性親和吸附裝置。該裝置由“吸附裝置”、隔熱裝置、磁力攪拌裝置及可控溫的恒溫槽構成。實驗前先將“吸附裝置”置于預冷的雙蒸水中,調節恒溫槽的溫度,降溫至-1.6 ℃。將其放入預冷的南極磷蝦蛋白質溶液中,通過調節恒溫槽降溫到所需要的溫度;同時磁力攪拌器以較低的轉速轉動保持體系均勻,進行南極磷蝦AFPs的分離純化。南極磷蝦AFPs提取結束后,將“吸附裝置”上的冰部分用預冷的雙蒸水沖洗,除去表面殘留的南極磷蝦蛋白質樣品,使冰部分與“吸附裝置”分離。將冰部分融化并保存進行下一步實驗。

采用Bradford法測定南極磷蝦AFPs的含量,以牛血清白蛋白為標準蛋白制作標準曲線并建立回歸方程:y=0.6614x-0.0009(R2=0.9975);式中:y為樣品中蛋白質含量,x為吸光度值;計算南極磷蝦AFPs的得率。

1.2.3 南極磷蝦AFPs熱滯活性(THA)的測定 采用DSC法測定南極磷蝦AFPs的THA。參照Ding等的方法并稍作改動[16]。將10 μL樣品密封于鋁坩堝中,放置在樣品池中央,以空鋁坩堝為對照。待設備運行穩定后,將體系溫度降至-30 ℃直至完全凍結,保持5 min便于系統穩定。然后,以1.0 ℃/min的速度升溫至20 ℃,樣品的熔點和熔化的吸熱面積被記錄。樣品的溫度再被降至-30 ℃,保持5 min。然后以同樣的速率緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態的溫度,稱為保留溫度(Th)。重復上述過程。樣品重結晶開始的溫度(T0)和重新凍結的放熱區域被記錄。THA參照如下公式計算:

THA=Th-T0

1.2.4 單因素實驗 在前期實驗的基礎上,分別考察了南極磷蝦蛋白濃度(0.8、0.9、1.0、1.1 mg/mL),吸附溫度(-1.7、-1.8、-1.9、-2.0 ℃),吸附時間(9、10、11、12 h),吸附次數(1、2、3、4次)等因素對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響,綜合考察后確定較佳的提取條件并進行后續實驗。

1.2.5 響應面實驗 在單因素實驗基礎上,以南極磷蝦蛋白質濃度、吸附溫度、吸附時間和吸附次數為實驗因素(自變量),以南極磷蝦AFPs得率與其THA為評價指標(自變量),根據響應面法分別進行回歸方程擬合及優化分析,確定實驗條件下的最優提取工藝。采用Design Expert(8.0.5)處理所得數據。實驗設計因素水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平表
Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

水平因素A樣品濃度(mg/mL)B吸附溫度(℃)C吸附時間(h)D吸附次數(次)-109-1791010-18102111-19113

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 樣品濃度對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響 由圖1可知,在樣品濃度0.8 mg/mL時,AFPs得率較低;隨著樣品濃度的提高,AFPs得率也在上升;當樣品濃度上升到1.0 mg/mL之后,AFPs得率趨于穩定。這可能是由于南極磷蝦AFPs受冰晶吸附能力的限制,達到一定的吸附飽和度無法進一步提高吸附率。此外,研究還發現若樣品濃度過高還可能造成非AFPs進入冰中,不僅浪費了樣品,而且造成了AFPs得率的“升高”。從圖1可以看出,THA隨樣品濃度的提高呈現先增加后下降的趨勢,在樣品濃度為1.0 mg/mL時THA最高;隨著樣品濃度從0.8 mg/mL提高到1.0 mg/mL時,吸附的AFPs量升高,THA相應的增大;但當樣品濃度超過1.0 mg/mL后,THA呈現略微下降的趨勢,這可能是由于樣品濃度過高,少量非AFPs進入冰中,造成THA表觀活性的降低。因此,綜合考慮,確定樣品的濃度為1.0 mg/mL較為合適。

圖1 樣品濃度對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響Fig.1 Effect of sample concentration on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.2 吸附溫度對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響 由圖2可知,隨著吸附溫度的降低,AFPs的THA呈現下降的趨勢,且AFPs得率呈現先升高后下降的趨勢,并在-1.8 ℃達到最高。如果這可能是由于體系的吸附溫度過低,冰部分的生長過快,樣品溶液凍結過快,溶液中的非AFPs被快速生長的冰晶 “俘獲”凍結于冰中,導致所提取的AFPs中含有一定量的非AFPs,引起AFPs的THA降低[13]。因此,南極磷蝦AFPs提取過程的吸附溫度不宜過低。同時,若體系的吸附溫度過高,冰的生長速度較慢,AFPs得率較低且耗時。因此,綜合考慮,確定吸附溫度選擇-1.8 ℃較為合適。

圖2 吸附溫度對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響Fig.2 Effect of adsorption temperature on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.3 吸附時間對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響 由圖3可知,當吸附時間為9 h時,南極磷蝦AFPs得率為23.4%;當吸附時間為10 h后,南極磷蝦AFPs得率為23.75%,得率提高了0.35%;當吸附時間從10 h到12 h,雖然時間延長了2 h,但是得率僅提高了約0.8%。這可能是因為樣品中AFPs的含量是一定的,所以,AFPs的得率無法一直提高。當大部分的AFPs吸附到冰中以后,繼續延長吸附時間,也不會對南極磷蝦AFPs的得率產生顯著影響。此外,吸附時間對THA的影響也不是很明顯,THA活性大約穩定在0.07 ℃左右。因此,綜合考慮,確定吸附時間10 h較為合適。

圖3 吸附時間對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響Fig.3 Effect of adsorption time on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.4 吸附次數對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響 由圖4可知,南極磷蝦AFPs得率基本保持在22.5%左右,吸附次數對南極磷蝦AFPs得率影響不顯著。但吸附次數對于南極磷蝦AFPs的THA影響較為顯著,采用1次吸附提取后,THA最低為0.071 ℃;采用2次吸附提取后,THA上升為0.078 ℃,表明南極磷蝦AFPs的純度明顯提高。但第3、4次吸附提取后,THA沒有明顯提高。因此,綜合考慮,確定吸附次數為2次較合適。

圖4 吸附次數對南極磷蝦AFPs得率及THA的影響Fig.4 Effect of adsorption number on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.2 特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFPs的條件優化

2.2.1 數學模型的建立 基于單因素實驗結果確定了4個主要影響因素,以樣品濃度、吸附溫度、吸附時間和吸附次數為自變量,以南極磷蝦AFPs得率與其THA為因變量,采用Design-Expert軟件的Box-Behnken原理設計4因素3水平的響應面實驗。結果見表2。

南極磷蝦AFPs得率(Y1)自變量的回歸方程:

Y1(%)=25.650+0.850A-0.096B+1.110C-0.023D+0.065AB-0.023AC-0.033AD+0.700BC-0.120BD+0.027CD-2.370A2+0.750B2+1.190C2+0.920D2

Y2=0.076+3.334×10-4A+7.292×10-4B+2.257×10-3C+1.000×10-3D-7.500×10-4AB+1.000×10-3AC-2.500×10-4AD+4.687×10-4BC+5.00×10-4BD+2.500×10-4CD-1.545×10-3A2-1.160×10-3B2+2.340×10-3C2-2.545×10-3D2

對該回歸方程及各項系數分別進行方差分析、顯著性檢驗,結果見表3。從表3中可以看出,回歸模型均達到顯著水平(p<0.01)。另外,模型的決定系數(R2)分別為0.9575和0.9457,均大于0.90,表明回歸模型對數據的擬合程度較好[17-18]。回歸模型的失擬性為不顯著,該模型的穩定性也較好。因此,模型在特定條件下能夠很好的預測自變量對響應值的影響。

表2 響應面實驗設計與結果
Table 2 Design and results of the response surface methodology

實驗號ABCD得率(Y1)THA(Y2)1-100-1234700702100-124770071300002556007640-1102821007850-1-10268700756001128960080700002539007580000253500769010-12746007210-1010248200771110-1024750074121-10025160073130101273600721400-1-1264700731511002421007416-1001231800731700-112637007518000025820077190-1012799007320101027050081210-1102717007922-10-10224300742300002614007624-1-100235600752510012461007326-11002287007327001-1289500772801-1026110075290-10-127620071

2.2.2 響應面分析 響應面圖形是響應面Y對應用于因素A、B、C、D所構成的三維空間曲面圖及在二維平面上的等高線圖,可以直觀地反映各因素和他們之間的交互作用對響應值的影響[19-20]。從表3中可以看出,以南極磷蝦AFPs得率為響應值,2個一次項(樣品濃度和吸附時間)和4個二次項達到顯著水平(p<0.05)。因此,可以認為在考察范圍內吸附溫度和吸附次數對南極磷蝦AFPs得率影響不顯著。在其他因素條件不變的情況下,以BC為例考察交互項對南極磷蝦AFPs得率的影響,結果見圖5,由圖可知,在樣品濃度和吸附次數固定的條件下,在考察范圍內,南極磷蝦AFPs的得率隨吸附時間的延長而逐漸增大,隨吸附溫度的升高先減小后增大。

圖5 吸附時間與吸附溫度對南極磷蝦AFPs得率影響的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the effect of adsorption time and adsorption temperature on the extraction yield of Antarctic Krill AFPs

2.2.3 最佳條件的確定及驗證實驗 利用Design Expert 軟件優化分析最佳實驗條件為:樣品濃度1.03 mg/mL,吸附溫度-1.70 ℃,吸附時間為11 h,吸附次數為2.23次。在此最佳實驗條件下,采用該模型預測南極磷蝦AFPs的得率為29.34%,THA為0.0805 ℃。考慮到實際操作的可行性,確定樣品的濃度為1.0 mg/mL,吸附溫度為-1.70 ℃,吸附時間為11 h,吸附次數為2次。

表3 南極磷蝦AFPs得率(Y1)回歸模型的方差分析結果
Table 3 Analysis of variance of the regression model of the extraction yield(Y1)

方差來源平方和自由度均方F值p值顯著性模型8611146152373<00001??A871873358<00001??B0099100990380546-C128E+011128E+014921<00001??D608E-031608E-03002308805-AB001710017006508022-AC203E-031203E-03781E-0309308-AD423E-031423E-03001609002-BC142114254700347?BD00551005502106515-CD303E-031303E-03001209155-A235541355413712<00001??B2332133212820003??C28481848327<00001??D25421542209100004??殘差36314026失擬性265902915103383純誤差098502總離差897328

注:*p<0.05,影響顯著;**p<0.01,影響非常顯著。

為了驗證響應面優化實驗模型的可靠性,擬采用上述優化條件進行南極磷蝦AFPs提取驗證實驗。經過實際測得南極磷蝦AFPs的得率為30.12%,THA為0.079 ℃,與模型預測值之間的相對誤差分別為2.66%和1.86%,說明響應面法優化獲得的預測值與驗證值較接近;表明該模型能夠較好的預測南極磷蝦AFPs的提取,進一步驗證了回歸模型的可靠性。

3 結論

本文以南極磷蝦蛋白質為原料,采用特異性親和吸附方法,通過單因素實驗和響應面法對南極磷蝦AFPs提取條件進行了優化,并建立了擬合度較好的數學模型。獲得的較優提取條件為樣品濃度1.0 mg/mL、吸附溫度-1.70 ℃、吸附時間為11 h、吸附次數為2次;在此條件下,南極磷蝦AFPs的預測得率為30.12%,THA為0.079 ℃;驗證值與預測值之間的相對誤差分別為2.66%和1.86%,表明該模型在特定范圍內具有較好地預測效果,期望本文的結果能夠豐富南極磷蝦AFPs的研究。

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Extraction of the antifreeze proteins from Antarctic Krill (Euphausia superba)by specific affinity adsorption

MA Qing-bao1,2,CHEN Xue-zhong1,LIU Zhi-dong1,*,QU Ying-hong2,WANG Yi-hong1,WANG Shuai1,2

(1.East China Sea Fisheries Research Institute,ChineseAcademy of Fishery Sciences. Shanghai 200090,China; 2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In this paper,the key factors and optimal conditions of extraction of Antarctic Krill AFPs(Antifreeze proteins,AFPs)were researched by specific affinity adsorption. On the basis of single factor experiment,sample concentration,adsorption temperature,adsorption time and adsorption number were optimized by response surface methodology with the AFPs extraction yield and THA as response value. The results indicated that the optimal extraction process was sample concentration of 1.0 mg/mL,adsorption temperature of-1.70 ℃,adsorption time of 11 h,the adsorption number of 2. Under the optimal conditions,the model optimum solution would be 29.34% and 0.0805 ℃. The relative errors were 2.66% and 1.86% between actual and model value. The fitted mathematical models for the extraction yield of Antarctic Krill AFPs and its THA had a good feasibility.

Antarctic krill;antifreeze protein;specific affinity adsorption;response surface methodology;optimization

2016-06-23

馬慶保(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用研究，E-mail：zd-liu@hotmail.com。

*通訊作者:劉志東(1976-)，男，博士，副研究員，研究方向：海洋生物資源利用研究，E-mail：zdliu1976@163.com。

上海市自然科學基金(13ZR1449900)；國家自然科學基金(31471687)；上海市科技興農項目(滬農科攻字(2015)第5-5號)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金 (2016HY-ZD0903)。

TS254.1

B

1002-0306(2016)23-0183-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.026