食源性生物活性肽指紋圖譜的含義與構建

蘇世偉,郭順堂,*,張 超,張 婷,梁 明

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510665)

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食源性生物活性肽指紋圖譜的含義與構建

蘇世偉1,郭順堂1,*,張 超2,張 婷2,梁 明2

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510665)

食源性生物活性肽具有顯著的生理功能,成為世界范圍內研究和開發的熱點。隨著生物活性肽產品的增多,建立針對特定種類肽的鑒定方法日益重要。本文在已有的關于食源性生物活性肽的研究基礎上,借鑒中藥的指紋圖譜技術,對建立用于鑒別生物活性肽的指紋圖譜的含義和構建方法進行了探討。肽指紋圖譜的建立可為肽產品行業的生產管理和真偽鑒定工作提參考。

食源性肽,生物活性,指紋圖譜

生物活性肽是指具有特殊生理活性的、可影響生物體機能和健康狀況的肽類物質[1],而食源性生物活性肽是指食物蛋白經水解后形成的寡肽、多肽及具有復雜線性、環形結構肽類的總稱[2],如酪蛋白磷酸肽、大豆抗氧化肽、乳源降血壓肽等。其中酶解法安全性高、工藝簡單、成本低,適于肽產品的大量生產[3]。近年來,國內外學者對生物活性肽的種類、結構、性質及制備方法進行了深入的研究,包括具有免疫調節、增強骨密度、降血壓、降血脂、抗氧化、改善腸道菌群等功能的肽類[4]。目前,已有多種生物活性肽產品上市,如核桃多肽飲料[5]、大豆多肽運動飲料[6]、雞皮膠原蛋白肽[7]等。

然而,隨著生物活性肽市場需求量的增加,肽產品的真偽和功能效果成為消費者關注的問題。但是,肽產品是由多種肽段組成的非均一性混合物,其生理活性受肽段的分子量、氨基酸組成、聚合結構等多因素影響[8],因此,僅根據肽的一種性質或特征難以對不同種類、功能或不同廠家生產的生物活性肽做出鑒別。

指紋圖譜技術是借助于現代分析技術手段對某一產品中能夠顯示其品種、產地及組成體系特征的穩定性成分進行分析和評價的一種綜合性鑒別方法,能夠鑒別產品真實性和評價質量一致性[9],例如,中藥指紋圖譜學可鑒別中藥種類、原料、物質作用基礎[10];葡萄酒指紋圖譜可用于鑒別葡萄酒的品種、產地、酒齡等[11]。

本文借鑒中藥和酒類指紋圖譜的概念和技術,結合生物活性肽的自身特點,對生物活性肽指紋圖譜的含義和構建方法進行了探討,其目的是為肽生產行業表征肽產品的功能和質量,進行生產管理和開展鑒偽工作提供參考。

1 生物活性肽指紋圖譜的含義

蛋白質組學中的肽指紋圖譜技術是指蛋白質被酶解或化學降解后肽段的分離分析技術[12],主要用于確定蛋白質的序列、鑒定蛋白質及分析蛋白質的完整性和準確性[12-14]。

與蛋白質的肽指紋圖譜不同,生物活性肽雖然也是蛋白質水解物,但生物活性肽的指紋圖譜不僅要包含蛋白質組學中的肽序列等內容,還應包括生理活性特征、基本性質,這樣才能鑒別肽產品的真實性、評價質量一致性和產品穩定性。基于生物活性肽的組成、性質、結構和功能的復雜性,需借助于化學分析、光譜和色譜等多種技術進行分析,獲得肽的物理化學和生物活性指紋特征。由于肽的生物活性與分子量分布、氨基酸組成、疏水性等多項因素決定[8],因此肽指紋圖譜需綜合多個方面的指標,包括原料特征、分子量分布、氨基酸組成、理化性質、二級結構特征、功能活性等,從而可較充分地反映出生物活性肽混合體系的整體狀況,實現對生物活性肽的原料區分、品質保證和工藝監測。

2 生物活性肽指紋圖譜的構建

2.1 構建生物活性肽指紋圖譜要遵從的原則

2.1.1 原料要求 構建生物活性肽指紋圖譜的目的是用于成分復雜、有效成分多樣的肽產品活性鑒別,保證產品批次間質量的穩定性,所以要求廠家必須固定原料的品種、產地、采收季節、貯藏條件和生產工藝。

2.1.2 檢測指標要求 生物活性肽的成分復雜,不僅有大量的分子量不同、性質各異的肽段,還有一些氨基酸、酚類、有機酸類萜類、生物堿類等成分。例如,Cudennec等[15]從褐蝦蛋白水解物中得到的促進縮膽囊素釋放的活性肽組分(1000 u

另外,一種肽段或肽類混合物可能有多種生物活性,如Meisel等[19]從牛奶蛋白水解物得到的六肽(TTMPLW)既有ACE抑制效果又有增強免疫力的作用;Srinivas等[20]酶解α-酪蛋白得到的肽類混合物同時有抗氧化、螯合Zn2+和抗菌的功效。同時,肽在貯存過程中會發生聚集[21],其性質也可能繼而發生變化。肽的生物活性也受生產工藝的控制,例如由于不同的蛋白酶有不同的酶切位點[22],因而會得到不同的肽段;通過不同的離子親和層析技術可得到具有不同金屬親和能力的肽段[23]。總之,生物活性肽的性質不穩定性及其活性受工藝影響的特定也決定了生物活性肽指紋圖譜的建立必須整合多個具有專屬性、重復性和可行性的指標。從復雜的數據中最大限度的提取信息,利于進一步揭示物質的隱含性質[24]。

2.1.3 檢測部門要求 生物活性肽指紋圖譜的應用與研究不能局限于研究與質檢部門,而應與生產、流通等部門相互協調,共同參與,才可保證圖譜的專屬性、重復性及實用性,使得生物活性肽指紋圖譜真正成為其質量評價的一種有效方法。

2.1.4 檢測方法和條件要求 指紋圖譜的實驗方法和條件的確定是研究檢測方法過程中最重要、最關鍵的內容,不論選擇何種技術,均應結合實際,選擇的原則必須具有良好的重現性和可行性。

2.2 生物活性肽指紋圖譜的構建

生物活性肽的類型和功能活性由兩方面決定——蛋白原料和生產工藝[25]。因此,為了全面了解一種生物活性肽,便于日后的真偽鑒別工作,需對肽的蛋白原料、生產工藝和生物活性3個方面進行研究,即建立的生物活性肽指紋圖譜需包括3個層次的“子指紋圖譜”:判別肽原料蛋白的指紋圖譜、肽生產工藝指紋圖譜、肽生物活性指紋圖譜。

2.2.1 “判別肽原料蛋白的指紋圖譜”的構建 食源性生物活性肽的原料來源廣泛,包括植物蛋白、動物蛋白、動植物副產物等,不同原料蛋白的成本、性質、氨基酸組成和序列不同。生物活性肽是存在于蛋白質中的特殊片段,與其原料蛋白的氨基酸組成和序列密切相關。活性肽在酶解后被釋放出來,顯示不同的功能活性[18,26-27]。因此,固定的蛋白原料是保證肽產品質量的前提,當確定了制備生物活性肽的原料蛋白后,其種類則被進一步確認,有利于下一步的分析和鑒別,所以要建立肽原料蛋白區分指紋圖譜。

肽原料蛋白區分指紋圖譜的建立可通過分析特征性次生代謝產物、特征氣味和HPLC-MS2測序追溯原料蛋白三種途徑實現。一些蛋白尤其是植物蛋白含有特殊的次生代謝產物,如菜籽蛋白中有菜籽堿,花生蛋白中含有白藜蘆醇,核桃蛋白中有酚類物質、大豆蛋白中有異黃酮等。由這些蛋白制備的肽也可能含有相應的特征次生代謝產物,因此對于這類生物活性肽,可根據通過其本身帶有的特征性次生代謝產物進行區分。一些蛋白可能結合有特殊風味,如牛血清白蛋白會結合有醛類、酮類等風味物質[28],這些物質在蛋白酶解中被釋放而可被檢測;而一些蛋白在酶解過程中可能生成特征性風味物質,例如小麥蛋白在酶解過程中發生美拉德反應而產生肉味[29]。因此,可以通過氣相色譜根據氣味特征對生物活性肽區分以明確其原料來源。若無特殊的標志性物質,則可通過HPLC-MS2測序追溯原料蛋白。

2.2.2 “肽生產工藝指紋圖譜”的構建 蛋白原料特征和生產工藝共同決定肽的類型和活性[30],所以當原料蛋白確定后,肽的性質(如分子量分布、兩親性、疏水性、肽含量、氨基酸組成、電荷性質等)和活性主要由生產工藝決定。生產工藝包括多個指標,如酶制劑的種類、酶用量、溫度、pH等。除此之外,還有為提高目標活性肽含量的純化或富集工藝,如Holder等[31]利用超濾系統相結合的多步循環膜反應器得到了ACE抑制能力提高13%的肽段組分;劉靜等[32]利用3種酶(堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)協同水解大豆蛋白制得相對分子質量主要集中在6000 u以下的大豆肽;Berot等[33]利用ZrO2載體膜技術分離得到疏水性肽段比例占77%～88%的肽段組分和親水性肽段比例為84%～90%的肽組分。這些處理工藝將會影響最終肽產品的化學性質和生物活性。因此,需要在生產的各個環節設定相應的檢測指標,如不同酶解時間點蛋白質的水解度;在純化或富集環節,中間產品的分子量分布、親水性-疏水性等特征;在濃縮、干燥、配制等環節,中間產品肽含量、生物活性等。

總之,需要掌控各個生產環節中相應產物的特征,利用各級中間產物的水解度、分子量分布、親水性-疏水性、電荷性質、生物活性等指標共同構建肽生產工藝的指紋圖譜,以對其工藝進行實時監測和有效追蹤。

2.2.3 “肽生物活性指紋圖譜”的構建 生物活性肽的功能活性最終由其氨基酸組成、序列和構型決定,若指紋圖譜能包含這3項指標,即對每批樣品的氨基酸組成、序列和構型進行定性和定量分析,則可明確地對這種生物活性肽進行防偽和質量控制。但此目的的實現需要兩個條件:單一的肽段組成,明確的結構-功能關系。然而,酶解得到的肽是一種混合物,它的功能活性無法和某一特征肽段建立專一的對應性,而可能是多個肽段共同作用的結果;再者,到目前為止,肽的結構-功能關系還沒有具體明確。因此,不可能將一個或幾個肽段的氨基酸組成或序列測定指標作為肽的指紋。

盡管肽的結構-活性關系沒有完全明確,但對一些肽的性質與功能活性的關系總結表明:肽的功能活性由分子結構、氨基酸組成、氨基酸序列決定,因此生物活性肽的結構-活性關系可由肽的化學性質與功能活性關系體現。目前所報道的肽的化學性質一般包括疏水性、兩親性、電荷性、分子量、微量元素結合能力等[34-37]。其中分子量是較重要的特征指標,如Meisel等[38]報道生物活性肽一般有2～20個氨基酸組成,Zeng等[39]發現牡蠣的水解物中,分子量在1～5 ku的范圍內的肽組分生物活性最強;Cudennec等[15]發現從蝦頭蛋白水解物中得到的分子量在1～1.5 ku的肽段組分可顯著影響縮膽素的釋放;Li等[16]報道分子量在500～1500 u的玉米肽段抗氧化活性更強。氨基酸組成和疏水性也是常用指標,如You[40]和Liu等[41]報道,富含組氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的肽有較強的清除DPPH自由基的能力;富含疏水氨基酸(如脯氨酸和羥脯氨酸)則能有效地抑制脂肪氧化,此類肽表現出較強的疏水性;富含帶正電荷的疏水區域的肽能更好地穿過細胞膜,因而有較強的抗菌功效[42];二級結構不同的肽,如α螺旋肽、β折疊肽和無定形肽的抗菌效果也有區別[43]。

由上可知,肽的生物活性主要與分子量、疏水性和二級結構有關,且這些特征性指標能通過高效液相色譜技術和紅外技術獲得,由此,肽生物活性指紋圖譜的建立應該主要分為6個步驟:

第一，通過凝膠色譜技術分離得到不同分子量分布的肽段組分;

第二，檢測各個組分的生物活性,得到單位質量生物活性最高的肽段組分;

第三，獲得凝膠色譜分離前總樣品和各個組分的分子量分布、疏水性、二級結構等特征;

第四，對照各個組分和總樣品的分子量譜圖、疏水性譜圖和紅外譜圖;

第五，得到總樣品和活性最高組分間共有的特有信息;

第六，匯總這些特有信息,構建能反應肽產品活性的指紋圖譜。

總之,以眾多的肽化學性質與功能活性關系理論為基礎,在明確一種肽的功能活性后,可利用與肽的生物活性相關的性質指標構建肽生物活性指紋圖譜。

2.3 生物活性肽指紋圖譜的校對、復核和最終確立

建立指紋圖譜的實驗方法和實驗條件必須經過嚴格的方法學驗證,即準確性(數據間的相近程度)、精密度(數據的離散程度)、耐用性(不同條件下分析同一樣品所得結果的變化程度)。因此,方法驗證的目的是證明采用的指紋圖譜測定方法具有可靠性和可重復性,符合指紋圖譜測定的要求。

3 總結

隨著生物活性肽產品種類的增多,建立肽的指紋圖譜日益重要。通過肽指紋圖譜,能夠鑒別肽產品的蛋白來源、監控其生產工藝、保證其生理活性。利于增加消費者對產品的可信度,維護企業形象,促進肽產品行業的長足發展。

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Signification and identification of food -derived bioactive peptides fingerprint

SU Shi-wei1,GUO Shun-tang1,*,ZHANG Chao2,ZHANG Ting2,LIANG Ming2

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Infinitus(China)Company Ltd.;Guangzhou 510665,China)

Food-derived bioactive peptides exert multiple biological functions and thus attract worldwide interests for research and application. The increasing prosperity of bioactive peptides products urges an accurate method for evaluation and determination of peptides products. Based on numerous researches of bioactive peptides in the passing decades,the definition and construction of fingerprint used for identifying bioactive peptides are discussed in the report. The fingerprint construction of bioactive peptides could serve as a theoretical reference for the production management and application in peptides food industry.

food-derived peptides;bioactive activities;fingerprint

2016-04-25

蘇世偉(1991-)，女，碩士，研究方向：生物活性肽指紋圖譜的構建，E-mail:shiwei_su@yahoo.com。

*通訊作者:郭順堂(1962-)，男，博士，教授，主要從事植物蛋白和肽的研究，E-mail:shuntang@cau.edu.cn。

TS207.7

A

1002-0306(2016)23-0396-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.066