聚乙二醇對不同木質(zhì)纖維底物酶解生產(chǎn)葡萄糖的影響

王新明,肖 林,覃樹林,劉立存,夏蕊蕊

(山東龍力生物科技股份有限公司 山東省秸稈煉制技術(shù)重點實驗室,山東禹城 251200)

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聚乙二醇對不同木質(zhì)纖維底物酶解生產(chǎn)葡萄糖的影響

王新明,肖 林,覃樹林,劉立存,夏蕊蕊*

(山東龍力生物科技股份有限公司 山東省秸稈煉制技術(shù)重點實驗室,山東禹城 251200)

研究了聚乙二醇(PEG)對纖維素酶水解兩種不同底物產(chǎn)葡萄糖的影響,添加PEG后兩種底物的纖維素生成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率均得到提高,PEG400濃度為9 g/L時轉(zhuǎn)化率達到最大值。PEG對經(jīng)酸處理的玉米秸稈的糖化促進效果(提高30%)大于經(jīng)酸堿處理的玉米秸稈(提高10%)。當反應(yīng)體系的固形物提高或酶加量增大時,PEG對糖化作用的促進效果降低。發(fā)酵實驗結(jié)果表明PEG對酵母無不良影響。

玉米秸稈,聚乙二醇,纖維素酶,糖化

以價格低廉的農(nóng)業(yè)廢棄物為原料,將其中的聚合糖——纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖等單糖,它們可以被微生物發(fā)酵制備乙醇、沼氣等[1-2]。利用生物酶水解木質(zhì)纖維素中的纖維素、半纖維素之前需要對原料進行一定的預(yù)處理,打破纖維素、半纖維素和木質(zhì)素形成的致密結(jié)構(gòu);降低纖維素和半纖維素的聚合度;除去木質(zhì)素對纖維素和半纖維素的包裹[3-4]。經(jīng)過有效的預(yù)處理后酶解效率會得到提高,但是與淀粉酶相比,纖維素酶的酶解效率仍然低得多。

纖維素酶是由外切酶、內(nèi)切酶和β-糖苷酶等組成的[5],其酶解效率低的主要原因是吸附-解吸底物速率低、酶非特異性結(jié)合木質(zhì)素失活等[6]。研究表明在糖化過程中添加一些蛋白質(zhì)、表面活性劑、脂類等可以提高酶解效率[7-9]。本文通過在酶解過程中加入聚乙二醇改善溶液性質(zhì),減少纖維素酶失活,考察聚乙二醇對纖維素酶水解不同底物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈 2015年收集于山東省德州市,晾干、粉碎后儲存于通風干燥處;纖維素酶(Cellic CTec2) 諾維信(中國)有限公司;聚乙二醇(PEG,聚合度n=400) 青島天力源生物科技有限公司;釀酒高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司;玉米漿 山東龍力生物科技股份有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

汽爆工藝實驗臺(QBS-200B) 鶴壁正道生物能源公司;ZHWY-100D恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TGL-18C高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將玉米秸稈剪切至1～2 cm,利用1%的硫酸浸泡過夜后淋干水分,置于汽爆臺,0.8 MPa保壓處理5 min,瞬時降壓排出,得到經(jīng)酸處理后的玉米秸稈(ATCS),測得纖維素含量約為50%,木質(zhì)素含量約25%;經(jīng)酸處理后的秸稈再用1%氫氧化鈉80 ℃保溫處理60 min。得到經(jīng)酸堿處理后的玉米秸稈(AATCS),測得纖維素含量約為80%,木質(zhì)素含量約5%。

1.2.2 酶解糖化 在250 mL三角瓶中加入干重為10 g的預(yù)處理的秸稈,加水使總體系達到100 g,利用1%的硫酸或1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH約為5,底物為AATCS的酶加量為0.035 g/g纖維素,底物為ATCS的酶加量為0.05 g/g纖維素,加入一定量的聚乙二醇(PEG400),使反應(yīng)液中PEG濃度為9 g/L。將三角瓶置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中,120 r/min、50 ℃進行糖化,反應(yīng)48 h取樣測定葡萄糖濃度,三平行實驗取平均值。實驗中通過改變PEG添加量、固形物含量、酶加量,考察PEG對糖化促進效果的影響。

1.2.3 發(fā)酵 糖化完成后,待糖化液降溫,加入0.4 mL玉米漿,4 mL活化好的酵母,密封,置于36 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。發(fā)酵反應(yīng)48 h后取樣測定乙醇濃度,三平行實驗取平均值。

1.2.4 酵母活化 取3 g葡萄糖溶于100 mL去離子水中,加入1 g釀酒高活性干酵母,搖勻,棉塞封口,置于34 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置4 h。

1.3 測定及計算方法

取1 mL糖化液于1.5 mL離心管中,8000 r/min離心10 min,取上清液25 μL于2.475 mL水中(×100),混勻,利用生物傳感分析儀測定樣品中葡萄糖濃度。

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中,8000 r/min離心10 min,取上清液25 μL于2.475 mL水中(×100),混勻,利用生物傳感分析儀測定樣品中乙醇濃度。

纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率(%)=葡萄糖濃度×糖化液體積×0.9/底物中纖維素質(zhì)量×100

纖維素乙醇轉(zhuǎn)化率(%)=乙醇濃度×發(fā)酵液體積×0.9/底物中纖維素質(zhì)量×0.511×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG對底物酶解產(chǎn)糖的影響

圖1中是纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率隨糖化液中PEG400添加量的變化,由圖可以看出,在經(jīng)酸堿處理的秸稈和經(jīng)酸處理的秸稈的糖化液中添加PEG,反應(yīng)48 h兩種底物的纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率均得到提高,兩種底物的糖化反應(yīng)中添加PEG的濃度為9 g/L時纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到最大值,其中經(jīng)酸堿處理的秸稈轉(zhuǎn)化率提高了約10%,經(jīng)酸處理的秸稈轉(zhuǎn)化率提高了約30%。

圖1 不同濃度PEG對底物酶解產(chǎn)糖的影響 Fig.1 Effects of different concentrations of PEG on glucose production注:(a)底物是AATCS;(b)底物是ATCS,圖2～圖5同。

PEG可以減少酶無效吸附木質(zhì)素,提高酶的利用率[10],因為PEG比纖維素酶更容易吸附木質(zhì)素,研究表明PEG比纖維素酶吸附底物中木質(zhì)素的能力高11倍多[11]。添加PEG對經(jīng)酸處理的秸稈糖化促進效果更為明顯,與文獻[12]中結(jié)果相同。當糖化液中PEG濃度為12 g/L時纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率與9 g/L時相比不再上升甚至下降,這可能是因為PEG與底物中的木質(zhì)素結(jié)合后,過量的PEG游離在溶液中會與纖維素酶系中的部分酶結(jié)合導(dǎo)致酶失活[13]。

2.2 底物濃度不同時PEG對底物酶解產(chǎn)糖的影響

圖2 底物濃度不同時PEG對底物酶解產(chǎn)糖量的影響Fig.2 Effects of PEG on glucose production under different substrate concentrations

圖2中是不同固形物含量下、是否添加PEG400時糖化反應(yīng)48 h后底物纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率的對比。由圖可以看出,經(jīng)酸堿處理的秸稈糖化反應(yīng)體系的固形物不大于10%時,添加PEG對糖化有促進作用;經(jīng)酸處理的秸稈糖化反應(yīng)體系的固形物在5.5%～11.5%之間,添加PEG對糖化均有促進作用,PEG可以改善固液傳質(zhì),加速底物與酶運動,這增加了酶與底物的吸附-解吸速率[14],當固形物濃度越高時這種作用效果越不明顯。

2.3 酶加量不同時PEG對底物酶解的影響

圖3中是不同酶加量下、是否添加PEG400時糖化反應(yīng)48 h后底物纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率的對比。由圖可以看出,經(jīng)酸堿處理的秸稈隨酶加量提高,纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率相應(yīng)提高,當酶加量小于0.05 g/g纖維素時,添加PEG可以促進糖化,當酶加量繼續(xù)提高后,PEG抑制糖化;經(jīng)酸處理的秸稈隨酶加量提高,纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高,在設(shè)計的酶加量范圍內(nèi),添加PEG對糖化均有促進。

圖3 酶加量不同時PEG對底物酶解產(chǎn)糖量的影響 Fig.3 Effects of PEG on glucose production under different enzyme loading

PEG對酶解反應(yīng)有促進作用,可以加速酶的吸附-解吸速率,減少酶吸附木質(zhì)素失活。但當反應(yīng)體系中酶過量時,過量的酶有可能會與PEG結(jié)合[13],降低了PEG改善傳質(zhì)的作用,導(dǎo)致糖化反應(yīng)速率降低。

2.4 酶加量不同時PEG對發(fā)酵的影響

圖4中是糖化反應(yīng)48 h后得到的糖化液進行接種、發(fā)酵48 h后產(chǎn)乙醇情況。圖中纖維素乙醇轉(zhuǎn)化率隨酶加量提高的變化趨勢與糖化反應(yīng)基本相同,可以說明添加PEG對發(fā)酵過程沒有負影響(酸堿處理中酶添加量0.05、0.065 g/g纖維素除外)。這在圖5中也可以直觀的看出。

圖4 酶加量不同時PEG對底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響 Fig.4 Effects of PEG on ehanol production under different enzyme loading

圖5 酶加量不同時PEG對底物酶解、發(fā)酵促進作用的直觀圖Fig.5 The visualized graph of the promoting effect of PEG on the enzymatic hydrolysis and fermentation under different enzyme loading

大量的實驗研究表明,聚乙二醇對纖維素酶水解纖維素有促進效果,可以提高和保持體系中酶活性。通過添加少量PEG,可以減少酶用量或?qū)⒏呋钚缘拿富厥昭h(huán)使用,從而降低產(chǎn)生成本[14-16]。聚乙二醇主要通過與纖維素酶競爭木質(zhì)素吸附位點,降低酶吸附木質(zhì)素失活來發(fā)揮作用,主要是β-葡萄糖苷酶[17]。文獻[18]中在糖化體系中添加少量木質(zhì)素有利于酶解反應(yīng)進行,這種游離木質(zhì)素也可以吸附底物中的木質(zhì)素與纖維素酶競爭木質(zhì)素吸附位點,與本文的結(jié)論并不沖突。

3 結(jié)論

玉米秸稈經(jīng)稀硫酸浸泡和蒸汽爆破處理后,原料中半纖維素大部分被除去;經(jīng)氫氧化鈉處理后半纖維素全部除去,木質(zhì)素大部分被除去。利用兩種底物考察聚乙二醇對纖維素酶水解纖維素產(chǎn)糖的影響。

聚乙二醇對兩種底物的纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率均得到提高。兩種底物的糖化反應(yīng)液中添加PEG的濃度為9 g/L時酶解率達到最大值。PEG對木質(zhì)素含量較高的經(jīng)酸處理的秸稈的促進效果大于經(jīng)酸堿處理的秸稈,前者纖維素葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高約30%,后者提高約10%,說明PEG可以有效降低纖維素酶吸附木質(zhì)素失活。當反應(yīng)體系固形物提高時,PEG對糖化的作用的促進效果降低,這說明PEG可以改善反應(yīng)體系傳質(zhì),提高酶吸附-解吸速率。當反應(yīng)中酶加量增大時,PEG對糖化作用的促進效果降低,說明反應(yīng)體系中過量的PEG和過量的纖維素酶間會發(fā)生吸附,導(dǎo)致酶活降低。底物水解得到的糖可以被酵母代謝產(chǎn)生乙醇,PEG對酵母無不良影響。

[1]Limayem A,Ricke S C. Lignocellulosic biomass for bioethanol production:Current perspectives,potential issues and future prospects[J]. Progress in Energy and Combustion Science,2012,8(4):449-467.

[2]畢于運,高春雨,王亞靜,等.中國秸稈資源數(shù)量估算[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2009,25(12):211-217.

[3]王新明,肖林,夏蕊蕊.木質(zhì)纖維素乙醇預(yù)處理技術(shù)研究進展[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2014(2):67-69.

[4]Nguyen T Y,Cai C M,Kumar R,et al. Co-solvent pretreatment reduces costly enzyme requirements for high sugar and ethanol yields from lignocellulosic biomass[J]. ChemSusChem,2015,8(10):1716-1725.

[5]羅鵬,劉忠.表面活性劑對麥草同步糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的影響[J].過程工程學(xué)報,2009,9(2):355-359.

[6]王新明,王聯(lián)結(jié),于猛.牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈的影響[J].食品工業(yè)科技,2012,33(19):194-196,200.

[7]Eckard A D,Muthukumarappan K,Gibbons W. Enhanced bioethanol production from pretreated corn stover via multi-positive effect of casein micelles[J]. Bioresource Technology,2013,135(2):93-102.

[8]Kumar R,Wyman C E. Effect of additives on the digestibility of corn stover solids following pretreatment by leading technologies[J]. Biotechnology and Bioengineering,2009,102(6):1544-1557.

[9]Li J H,Li S Z,Fan C Y,et al. The mechanism of poly(ethylene glycol)4000 effect on enzymatic hydrolysis of lignocellulose[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2012,89(1):203-210.

[10]陳洪章,李佐虎.影響纖維素酶解的因素和纖維素酶被吸附性能的研究[J]. 化學(xué)反應(yīng)工程與工藝,2000,16(1):31-37.

[11]Vaidya A A,Newman R H,Campion S H,et al. Strength of adsorption of polyethylene glycol on pretreated Pinus radiata wood and consequences for enzymatic saccharification[J]. Biomass and Bioenergy,2014,70:339-346.

[12]Lu Y P,Yang B,Gregg D,et al. Cellulase adsorption and an evaluation of enzyme recycle during hydrolysis of steamexploded softwood residues[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2002,98(1):641-654.

[13]Ximenes E,Kim Y,Mosier N,et al. Inhibition of cellulases by phenols[J]. Enzyme and Microbial Technology,2010,46(4):170-176.

[14]Ouyang J,Dong Z W,Song X Y,et al. Improved enzymatic hydrolysis of microcrystalline cellulose(Avicel PH101)by polyethylene glycol addition[J]. Bioresource Technology,2010 101(17):6685-6691.

[15]Eriksson T,B?rjesson J,Tjerneld F. Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocelluloses[J]. Enzyme and Microbial Technology,2002,31(3):353-364.

[16]Ouyang J,Ma R,Huang W T,et al. Enhanced saccharification of SO2catalyzed steam-exploded corn stover by polyethylene glycol addition[J]. Biomass and bioenergy,2011,35(5):2053-2058.

[17]Sipos B,Szilágyi M,Sebestyén Z,et al. Mechanism of the positive effect of poly(ethylene glycol)addition in enzymatic hydrolysis of steam pretreated lignocelluloses[J]. Comptes Rendus Biologies,2011,334(11):812-823.

[18]Wang W X,Zhu Y S,Du J,et al. Influence of lignin addition on the enzymatic digestibility of pretreated lignocellulosic biomasses[J]. Bioresource Technology,2015,181C:7-12.

Effect of polyethylene glycol on enzymatic hydrolysis for glucose production with different lignocellulosic substrates

WANG Xin-ming,XIAO Lin,QIN Shu-lin,LIU Li-cun,XIA Rui-rui*

(Shandong Key Laboratory of Straw Biorefinery Technology, Shandong Longlive Biotechnology Co.,LTD,Yucheng 251200,China)

The effects of polyethylene glycol(PEG)on the production of glucose from two different substrates by cellulase hydrolysis were studied. The conversion of cellulose to glucose was improved after the addition of PEG to the two substrates. The conversion rate reached maximum value when PEG concentration was 9 g/L. The promoting effect of PEG on acid-treated corn straw(increased by 30%)was greater than the acid-alkali-treated corn straw(increased by 10%). The promoting effect of PEG on saccharification was reduced when the solid content of the reaction mixture was increased or the amount of the enzyme was increased. The fermentation experiment showed that PEG had no adverse effect on yeast

corn straw;polyethylene glycol;cellulase;saccharification

2016-05-12

王新明(1988-)，碩士，工程師，研究方向：生物質(zhì)綜合利用，E-mail：wangxinming@longlive.cn。

*通訊作者:夏蕊蕊(1978-)，女，博士，高級工程師，研究方向：生物質(zhì)開發(fā)與利用，E-mail：xrr@longlive.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2014AA021903)；山東省科技重大專項(2015ZDXX0403A01)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)23-0135-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.017