鉛和鎘對牦牛腎臟細胞的影響

劉祥軍,孫萬成

(青海大學農牧學院,動物科學系,青海西寧 810016)

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鉛和鎘對牦牛腎臟細胞的影響

劉祥軍,孫萬成*

(青海大學農牧學院,動物科學系,青海西寧 810016)

為了揭示牦牛腎臟細胞在重金屬脅迫下的毒理性影響,在培養出的腎臟細胞中加入不同濃度的重金屬離子鉛(Pb2+)和鎘(Cd2+),提取總RNA,在逆轉錄酶的作用下生成cDNA,利用實時熒光定量技術檢測牦牛腎臟細胞中金屬硫蛋白mRNA的相對表達量。結果顯示,將牦牛腎臟細胞中加入重金屬濃度為0 μmol/L的值設定為對照組,2-ΔΔCt值設為1時,加入重金屬鉛的不同濃度0、5、10、20、30 μmol/L 的樣品相對定量五種不同濃度的樣品的2-ΔΔCt分別為0.489、0.603、0.796、3.031;添加鎘的五種不同濃度的樣品的2-ΔΔCt分別為5.280、3.530、8.110、11.630。通過差異性顯著分析得出當重金屬離子鉛(Pb2+)和鎘(Cd2+)添加10 μmol/L時對腎臟細胞的生長有明顯的抑制作用,相應的金屬硫蛋白mRNA表達量較高,通過mRNA相對表達量的比較得出重金屬鎘的毒性比鉛強,當重金屬的添加量比較低時,重金屬離子通過結合MT降低對腎臟細胞的毒害作用。

金屬硫蛋白,牦牛腎臟細胞,重金屬

牦牛是高寒地區的特有牛種,草食性反芻性動物,青藏高原主要的畜牧資源,青海省是我國牦牛的主要產區。有“高原之舟”的牦牛對高海拔寒冷的青藏高原比其他物種有著更明顯的生存優勢,還為牧民提供大量奶源、肉源,更多的勞動力資源[1]。牧民們對牦牛肉制品具有很強的依賴,隨著國家對西部大開發的支持,礦業的發展,部分地區難免暴露在重金屬污染的環境中,間接的就增加了牧民們重金屬中毒的風險。重金屬很難被一般的方法降解或者利用,并有相當強的富集作用,毒害人體健康,其中給人們帶來最大困擾的有汞、鎘、鉛等強致病的重金屬離子[2-4]。當這些重金屬濃度富集到了某種生物體自身能夠承受限度的時候,生物體的生長就會出現不適,產生病變,嚴重影響生物體的生命活動,甚至會導致死亡[5]。根據國際腫瘤研究機構(IARC)的研究,把鎘劃為I類致癌物[6],還有研究表明鎘致癌機理是受到激活的原癌基因影響[7],美國毒物與疾病登記署(ATSDR)和美國環境保護署(USEPA)把鎘定為20種最具毒性物質中的一種物質[8]。鎘進入組織以后與巰基結合影響組織代謝,或者代替某些金屬離子參與組織代謝從而使得組織的某些功能喪失或者改變,影響細胞的生長[9];鉛的強毒性表現為對抗氧化酶系統的抑制[10]。單一的重金屬具有強毒性,環境中的毒性往往是多種金屬相互作用的結果,重金屬兩兩的混合毒性常表現為協同作用[11],房燕[12]等研究表明鎘和汞復合組DNA損傷大于汞脅迫組。

金屬硫蛋白(metallothionein簡稱MT),分子量低,對多種重金屬有較高的親和性,每個MT分子可以結合7～12個金屬離子[13]的蛋白質。最早是由Margoshes和Valee發現并分離出來的[14]。MT存在范圍較廣,在低等微生物、植物中均發現了MT[15],李令媛等在大鯢[16]、刺猬[14]中也分離得到MT。MT普遍存在于各種生物體中[18-19],其中以肝臟和腎臟中含量最為豐富,它能廣泛地被重金屬、激素、以及其他環境因素誘導表達合成[18]。MT在清除自由基的同時還影響細胞代謝、解除重金屬的毒性[20],對神經敏感性的也有一定的改善[21],延長人的壽命[22]。環境中廣泛存在的金屬硫蛋白,以及其能與多種重金屬完美的結合的特性,就能夠通過檢測MT的含量實時對飲食、環境做出監測,所以MT常被用作環境監測中重金屬暴露的生物標記物[23]。

金屬硫蛋白的檢測方法已經很成熟了,酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、DTNB比色法[24]、氨基酸分析法[25]、毛細管電泳法[26]、石墨爐原子吸收光譜法[27],論文的主要內容是研究重金屬鎘、鉛對牦牛腎臟細胞的影響,采集牦牛的腎臟組織進行細胞培養,待組織周圍長出新細胞(培養時間為一個月)后,通過添加不同濃度、不同品種的重金屬進行測定,以尋找重金屬與金屬硫蛋白mRNA的對應關系,反之可以通過檢測金屬硫蛋白mRNA的表達量,來檢測重金屬含量,預測環境中的重金屬含量[28],起到環境安全的預警作用,為食品安全評價提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛腎臟組織 果洛縣采集屠宰后(采集樣品使用的手術刀、剪刀、鑷子等都經過180 ℃,3 h滅菌處理),保存在生理鹽水中,置于冰盒中備用。

DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素、胰蛋白消化酶、小牛血清、PBS緩沖液、移液槍和微量吸頭、細胞培養瓶(25 cm2)、核酸染料(4s Red Plus Nucleic Acid Stain) 上海生物工程技術股份有限公司;RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖、熒光定量染料(SYBR Green II) 寶生物工程有限公司;DHG-9070A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;2-16KL冷凍離心機 德國SiGMA公司;GeneAMP PCR System 9700 PCR儀 美國ABI公司;JY600電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司;WD-9413A凝膠成像分析儀 北京市六一儀器廠;CFX96熒光定量儀 美國BIO-RAD公司;牦牛MT基因cDNA合成的引物 上海生物工程技術股份有限公司設計合成。

表1 牦牛MT基因cDNA克隆引物
Table 1 cDNA primer of yak metallothionein gene

引物名稱引物類型序列信息(5′-3′)MT1FforwardTGCACCGCGGGTGAATCCTGMT1RreverseAGACGCAGCCCTGGGCACACTTβ-actinFforwardGAGGCTCAGAGCAAGAGAGGCβ-actinRreverseCGTTGTAGAAGGTGTGGTGCC

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛腎臟細胞培養 牛腎臟組織于滅菌消毒的培養皿中,加入5 mL生理鹽水,清洗血跡污垢;加入2 mL生理鹽水,沖洗組織3次;向培養皿中加入2 mL生理鹽水,剪取一小塊組織;沿培養皿底部將組織剪碎成約1 mm3[29]的小塊;靜置片刻棄掉培養皿上層澄清液體,繼續向培養皿中添加2 mL生理鹽水,沖洗組織小塊3次;用DMEM培養液沖洗剪碎后的組織小塊,輕輕吹打3～5次,吸出并移入無菌培養瓶中;將將培養瓶放于超凈工作臺內,放置2～4 h后,添加17 mL的含小牛血清的DMEM培養基于各培養瓶中,隔天換培養基[30]。培養條件[31]:將經過上述處理好的培養瓶置于CO2培養箱中,培養溫度37 ℃,CO2的濃度為5%,培養時間設定為1個月。每天用熒光倒置顯微鏡觀察各組培養瓶中的組織生長狀況。

1.2.2 牦牛腎臟細胞中加入不同濃度重金屬鉛與鎘溶液 實驗前配置重金屬鉛(Pb2+)標準溶液濃度為0.00011 μmol/L,重金屬鎘(Cd2+)標準溶液的濃度為0.00015 μmol/L,培養液總體積為10 mL(根據培養瓶定),添加不同體積的標準溶液,以達到實驗要求的不同濃度的培養液,在培養液中加入重金屬離子12 h后提取RNA。

表2 重金屬離子鉛培養液的配制
Table 2 The nutrientsolution of heavy metal lead

濃度(μmol/L)加入重金屬鉛溶液體積V1(mL)培養液體積V2(mL)00010050595100991201882302773

表3 重金屬鎘培養液的配制
Table 3 Thenutrientsolution of heavy metal cadmium

濃度(μmol/L)加入重金屬鎘溶液體積V1(mL)培養液體積V2(mL)00010050397100793201387302080

1.2.3 牦牛腎臟細胞總RNA的提取 將培養瓶中培養液倒出,使用PBS清洗3次;向瓶中加入2 mL胰消化酶,37 ℃水浴3 min,離心棄上清液,向離心管中加入350 μL Buffer RL;吸取裂解液到新的1.5 mL RNase Free Tube中;向上述離心管中加入與液體等體積70%的乙醇,將溶液混均勻,立即將混合液全部轉入到RNA Spin Column,12000 r/min,離心1 min,棄廢液;加入500 μL的Buffer RWA,12000 r/min離心30 s,棄廢液;加入600 μL的Buffer RWB,12000 r/min離心30s,棄廢液;將RNA Spin Column重新安置于2 mL Collection Tube上,12000 r/min離心2 min棄廢液;加入70 μL的RNase Free dH2O,靜置5 min;12000 r/min離心2 min洗脫RNA,保存于-80 ℃保存。

1.2.4 電泳 稱取瓊脂糖0.2 g,1xTAE 20 mL,添加1 μL核酸染料,配置成1%的瓊脂糖凝膠,110 V,30 min條件下進行電泳,并在電泳凝膠成像儀上拍照檢測RNA的完整性。

1.2.5 牦牛腎臟細胞金屬硫蛋白cDNA的合成 牦牛腎臟細胞中提取的Total RNA為模板,按試劑盒推薦方法進行操作,按37 ℃ 15 min,85 ℃ 5s條件下反轉錄,反轉錄得到的cDNA是雙鏈結構,性質比較穩定,可以在4 ℃的條件下保存較長的時間。

表4 PCR反應液
Table 4 The PCR reaction solution

試劑使用量(μL)5×PrimeScriptBuffer(forRealTime)4PrimeScriptRTEnzymeMixI1OligodTPrimer(50μmol/L)1Random6mers(100μmol/L)1TotalRNA2RNasefreewater11

1.2.6 金屬硫蛋白實時定量PCR 以合成的cDNA為模板熒光定量,條件:95 ℃ 30 s 1個循環;95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s,39個循環;熒光定量時,除了加入引物MT1F-MT1R做實時定量PCR外,還必須做內參β-actinF-β-actinR的實時定量PCR。

表5 熒光定量反應液
Table 5 RealtimePCR reaction solution

試劑使用量(μL)模板DNA2上游引物(10～20pmol)1下游引物(10～20pmol)1熒光酶12.5Total25

2 結果和分析

2.1 細胞處理前后結果

圖1在10倍倒置熒光顯微鏡下觀察到:圖A為加入重金屬離子之前的細胞形狀呈橢圓形,細胞完整,培養液澄清透明,細胞沒有發生死亡;圖B為加入濃度20 μmol/L重金屬鎘(Cd2+)之后的細胞,細胞的形狀呈現不規則的多邊形,培養液變渾濁,一些細胞呈現亮斑,表明細胞已經發生死亡。

圖1 加入重金屬鎘離子前后的牦牛腎臟細胞Fig.1 The difference of yak cells in the kidney after added Cadmium

2.2 提取RNA的檢測

圖2中A圖是RNA電泳凝膠圖,圖中28 s條帶亮度是18 s條帶的2倍,而28 s的條帶亮度較低,RNA有所降解。B圖為RNA反轉錄合成的cDNA電泳凝膠圖,圖中MT的cDNA長度在100～250 bp之間滿足擴增目的DNA的長度,獲得約150 bp的DNA片段[32]。

圖2 電泳結果圖Fig.2 Electrophoresis results注：A：1～6分別表示0、5、10、20、30、30 μmol/L,B圖同。

2.3 金屬硫蛋白PCR熒光定量

表6 重金屬鉛脅迫細胞的熒光定量PCR
Table 6 The realtime PCR of yak cell under heavy metal lead stress

鉛的濃度(μmol/L)牦牛金屬硫蛋白引物反應Ct值內參β-actin反應Ct值Cq1Cq2Cq3平均CqCq1Cq2Cq3平均CqΔct平均值029382944295729462053203221052063029662908291329292190202321872133839028172880285328501998201220232011529392913298429451886187719281897527502713275727401909198719571951942528662846278028311883178918541842102799272628012775180917981831181210264326532683265918431821180718239121027872628272427131788173418021775202441240925152455157015511603155820241424092408241015231655155415778722024722501251224951621160216031609302479248725082491173617341765174530276127512741275121642212217421836793026642721256426491904198718891927

表7 重金屬鎘脅迫細胞的熒光定量PCR
Table 7 The realtime PCR of yak cell under heavy metal cadmium stress

鎘的濃度(μmol/L)牦牛金屬硫蛋白引物反應Ct值內參β-actin反應Ct值Cq1Cq2Cq3平均CqCq1Cq2Cq3平均CqΔct平均值028472964292929132123209020992104027722743273827512118210920782102655026132622261826182089205621882111521722143213821511832181018081849522232275223522681875185318211829415523152289230723041789180118121801102238225722422246174917931810178410223423072301228117561788179717804731023122252226222751801182118341819202141211021962149175717331733174120211421752123213717681741173117473532021982003206120871801181117891800302387237823902385208821162091209830228623292316231019561947191619273013022782362231523182018208921172075

以濃度0 μmol/L的樣品為對照樣品,將對照組的2-ΔΔCt值設為1進行閾值比較,通過比較閾值法(2-ΔΔCt)進行相對定量[33],根據公式:2ΔΔCt=2-[(實驗組MT Ct-實驗組β-ACTIN Ct)-(對照組MT Ct-對照組β-ACTIN Ct)],將對照組(0 μmol/L)的2-ΔΔCt設定為1,計算得到重金屬鉛的五種不同濃度的樣品2-ΔΔCt的分別為0.489、0.603、0.796、3.031;重金屬鎘的五種不同濃度的樣品的2-ΔΔCt分別為5.280、3.530、8.110、11.630。

圖3 MT mRNA相對定量拷貝數Fig.3 MT mRNA relative quantitative copy number

圖3為MT mRNA相對定量的拷貝數,從圖中可以看出,加入相同濃度的重金屬鎘比重金屬鉛的MT mRNA相對定量的拷貝數要高,根據測定的Ct值,還可以看出加入重金屬的濃度越高MT mRNA相對定量的拷貝就越高,牦牛腎臟細胞中加入重金屬鎘的金屬硫蛋白mRNA表達量相對較高,重金屬鉛的MT mRNA表達量較低,總體來說重金屬的濃度越高,MT mRNA相對定量值就越大。

根據測定的Ct值,利用SPASS17.0分析軟件計算得出重金屬鉛的不同濃度之間金屬硫蛋白含量的差異顯著性如表8、表9。

由表8可以看出鉛的不同濃度之間MT含量差異顯著性,濃度為0 μmol/L和5 μmol/L之間差異不顯著,0、10、20、30 μmol/L之間MT含量差異顯著。

由表9可以看出鎘的不同濃度之間MT含量差異顯著性,濃度為0 μmol/L和5 μmol/L之間差異顯著,與10、30 μmol/L之間MT含量差異顯著,與20 μmol/L差異不顯著可能是因為與mRNA的降解有關。

表8 鉛的不同濃度之間MT含量差異顯著性分析表
Table 8 Significant differenceanalysis of MT contentin different concentrations of lead

不同濃度(μmol/L)05102030300027?0021?00850018?1000200045?0038?0026?1000100019?0012?100050679100001000

注：*表示兩樣品之間的MT含量差異顯著p<0.05。

表9 鎘的不同濃度之間MT含量差異顯著性分析表
Table 9 Significant differenceanalysis of MT contentindifferent concentrations of cadmium

不同濃度(μmol/L)05102030300042?0011?00070021?10002000630011?0014?1000100049?0034?100050053?100001000

注：*表示兩樣品之間的MT含量差異顯著p<0.05。

3 結論

根據2-ΔΔCt比較法,將濃度為0 μmol/L的樣品的2-ΔΔCt設定為1,加入不同濃度重金屬鉛的樣品得到2-ΔΔCt的分別為0.489、0.603、0.796、3.031;加入不同濃度重金屬鎘的樣品的2-ΔΔCt分別為5.280、3.530、8.110、11.630;當鎘(Cd2+)添加5 μmol/L時腎臟細胞中MT有明顯的產生，當鉛(Pb2+)添加量10 μmol/L時 ,腎臟細胞中MT有較為明顯的產生；由mRNA相對表達量可知,重金屬鎘和鉛可以促使金屬硫蛋白mRNA的表達,并且隨著重金屬濃度的增加mRNA的表達量就相應的增加。

綜上所述重金屬鎘和鉛可使腎臟細胞生成大量的金屬硫蛋白mRNA,螯合生成金屬硫蛋白的含量就越多,超過某種細胞的耐受限度,細胞就會發生死亡[5],表明能通過與MT的結合可以有效的減輕重金屬對機體的毒害。重金屬濃度高,MT含量就越高,通過金屬硫蛋白的mRNA表達量比較,可以反映出牦牛體內的重金屬含量,預測環境中的重金屬污染程度,起到環境安全的預警作用,同時也可以為食品安全提供數據支持。

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Effects of lead and cadmium on yak kidney cells

LIU Xiang-jun,SUN Wan-cheng*

(Department of Animal Science,College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining 810016 China)

In order to reveal the yak kidney cells’poison rational influence under the stress of heavy metal,in the produce of kidney cells with different concentrations of heavy metal ions of lead(Pb2+)and cadmium(Cd2+),metallothionein mRNA expression of yak kidney cells were detected by Real-time PCR. It showed that the value of sample after added five different concentrations of heavy metal lead were 0.489,0.603,0.796,3.031 and the value of sample of the five different concentrations of heavy metal cadmium were 5.28,3.53,8.11,11.63,respectively,when adding different concentrations of heavy metal 0,5,10,20,30 μmol/L into the yak kidneycells. The result showed that it had obvious inhibitory effect on growth when added 10 μmol/L Pb2+and Cd2+into the kidney cells,and the corresponding amount of mRNA expression of metallothionein was relatively high,and the toxicity of heavy metal Cd2+was stronger than Pb2+comparing to the relative expression of mRNA,and the toxicity of cells was reduced by combining MT when heavy metal content was relatively low.

matallothionein;Yak kidney cells;heavy meta

2016-07-11

劉祥軍(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：反芻動物營養與生產，E-mail：1102961429@qq.com。

*通訊作者:孫萬成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品質量與安全，E-mail：sun.wancheng0108@aliyun.com。

國家自然基金項目(31160215)。

TS251.7

A

1002-0306(2016)23-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.016