高溫脅迫下皺紋盤鮑不同養殖群體心率變化比較

林思恒1, 2, 3, 4, 吳富村1, 3, 4, 張國范1, 3, 4

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京100049; 3. 海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266071; 4. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態養殖技術國家地方聯合工程實驗室, 山東 青島 266071)

高溫脅迫下皺紋盤鮑不同養殖群體心率變化比較

林思恒1, 2, 3, 4, 吳富村1, 3, 4, 張國范1, 3, 4

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京100049; 3. 海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266071; 4. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態養殖技術國家地方聯合工程實驗室, 山東 青島 266071)

高溫是海水貝類度夏死亡的環境誘因之一。本研究應用一種非損傷性的心率檢測方法, 檢測兩個皺紋盤鮑養殖群體在高溫脅迫條件下心率等生理指標的變化, 嘗試以心率變化指標比較這兩個群體高溫耐受能力。由于高溫脅迫下皺紋盤鮑的心率隨溫度變化的關系符合阿倫尼烏斯(Arrhenius)公式, 且心率隨溫度上升呈先上升后下降趨勢, 該研究通過計算兩者直線擬合拐點即阿倫尼烏斯拐點溫度(ABT, Arrhenius break temperatures)指標, 用以指示皺紋盤鮑溫度耐受程度。以此法對皺紋盤鮑兩個群體(高溫耐性, 對照)各17個個體進行了測定分析, 結果表明: 兩個群體間的ABT存在顯著差異, 高溫耐性組的皺紋盤鮑的ABT顯著高于對照組(P＜0.05); 個體ABT指標的高低與測定個體的殼高呈正相關(P＜0.05)。本研究首次將探討了高溫脅迫下皺紋盤鮑心率變化規律, 并以ABT為指標分析比較了兩個皺紋盤鮑養殖群體間高溫耐受能力, 結果對研究皺紋盤鮑和其它貝類溫度脅迫下生理響應及抗逆選育具一定借鑒意義。

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai); 心率測定; 高溫脅迫; ABT

鮑養殖產業隨著雜交技術的產業化應用及淺海養殖技術等的革新, 年產量已超過100000 t。近年來,皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)已經成為福建海區的主要養殖鮑物種, 且福建的養殖鮑產量約占全國總產量85%。然而皺紋盤鮑作為北方自然分布的物種, 在轉移到南方海區的養殖過程中, 尤其是近年來遭遇了度夏死亡的問題, 每年的度夏死亡造成了皺紋盤鮑養殖產業的巨大損失[1-2]。

夏季大規模死亡一直是困擾經濟貝類的主要問題之一, 雖然根本原因尚未有定論, 但學界普遍認為是環境因素[3-4]、貝類生物的生理狀態[5-6]和病原微生物的富集[7-9]等交互作用引起的。高溫是導致海水貝類夏季死亡的重要原因, 目前海水貝類高溫脅迫的生理響應及適應機制已成為研究熱點, 已有許多研究針對貝類動物高溫耐受能力進行初步研究, 如對近江牡蠣的致死溫度[10]、高溫下蝦夷扇貝存活率[11]以及皺紋盤鮑幼苗高溫存活率的研究[12]。然而這些研究都是采用對貝類動物進行高溫脅迫, 逐漸升高處理溫度, 當出現死亡時, 記錄致死溫度的方法, 其表型記錄僅為生存與否(二分類數據), 且存在溫度測定不夠準確的問題。開發新型的測皺紋盤鮑個體的高溫耐受能力的檢測方法及表型評價方法將有效解決這一問題。

心率的測定是一種重要的反映生物代謝水平變化的方法。衡量高溫脅迫時皺紋盤鮑的心率變化可以用于評估皺紋盤鮑對高溫的耐受能力。早在1990年, 無脊椎動物心率就能通過紅外線信號的方法被穩定測定[13], 阿倫尼烏斯拐點溫度(Arrhenius break temperatures, ABT)指標最早在1996年被用于表現潮間帶瓷蟹的高溫耐受程度[14]。根據阿倫尼烏斯方程,心率與溫度兩者之間存在線性關系。通常動物體的心率會先隨著溫度上升而上升, 表現了代謝速率的加快; 當溫度超過了動物體的承受范圍時, 心率會隨著溫度上升而下降, 意味著機體受到了影響。這兩個階段過程中心臟活動急劇下降的溫度被稱為ABT指標, 可以用于量化機體的高溫耐受程度。該方法具有非損傷性、進行原位測定的優點, 而且得到的指標可以精準量化, 已經用于濱螺、帽貝和貽貝等動物的心率測定[15-16]。本研究首次探討了高溫脅迫下皺紋盤鮑心率變化規律, 并以ABT指標分析比較了兩個皺紋盤鮑養殖群體間高溫耐受能力。本文對鮑等溫度脅迫下生理響應及抗逆選育等研究等具一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取來自寧德海區(26°69′N, 119°72′E)和青島海區(36°25′N, 120°69′E)的兩個皺紋盤鮑養殖群體(均為一齡個體)。其中寧德海區的皺紋盤鮑群體對度夏存活性狀經三代選育, 且一直在南方海區飼養,具有相對較強的溫度耐受性。而青島海區皺紋盤鮑群體作為對照, 未經度夏存活性狀選育, 假定其不具備高溫耐受性, 稱為對照群體。兩個皺紋盤鮑群體分別從海區運至實驗室后, 在實驗養殖池內暫養兩周, 期間每日更換海水, 常規方法投喂至實驗開始。之后分別從兩個群體內挑選17個個體進行心率測定。實驗于2014年12月至2015年2月進行, 該階段實驗室養殖池海水溫度為10～12℃。

1.2 方法

1.2.1 心率測定方法

心率測定采用一種非損傷性的方法[17-18], 將紅外傳感器用藍丁膠(Blu-Tack, Bostik Ltd, UK)固定在鮑魚心臟對應的殼表面[19]。心跳產生的光電流信號經放大器(AMP 03, Heartbeat monitor, Newshift, Portugal)放大過濾處理后, 被記錄并展示在簡易示波器軟件(Powerlab 8/30, AD Instruments, Germany)上, 利用內置軟件(LabChart Version 8.0)可以計算出每分鐘心率(bpm)。

1.2.2 升溫設備

開始測定時將待測定的皺紋盤鮑個體與設備連接完好后, 放入設定為15℃的控溫循環水浴鍋內(鮑魚實際放置在水浴鍋內的裝有海水的圓形玻璃槽(25 cm× 25 cm×20 cm)內, 所測溫度均為海水溫度, 下同)。當個體心率信號穩定后, 開始升高水浴溫度, 每次增加0.5℃。每增加一次溫度后至海水溫度也上升0.5℃后, 維持2 min后再繼續升溫, 直至皺紋盤鮑腹足從玻璃槽壁脫離。實驗過程中通過溫度測定儀嚴格記錄溫度(Fluke 54II, Fluke, WA, USA)。結合持續收集的心跳信號, 可以得出升溫過程中每個溫度對應的心率, 通過計算求得每個個體的ABT(℃)。

1.2.3 不同群體皺紋盤鮑個體心率測定

隨機選取高溫耐性和對照組的皺紋盤鮑群體一齡個體各17個, 進行心率測定, 升溫區間為15～35℃,持續時間不超過2 h, 并對每個實驗個體進行生長性狀測定, 包括殼長(mm)、殼高(mm)、殼寬(mm)和體濕質量(g)。

1.3 數據處理

用示波器Powerlab內置軟件LabChart分析不同時間點的心率數據, 選取升溫過程中溫度穩定階段期間的心率作為該溫度對應心率。根據阿倫尼烏斯方程

式中, k為每分鐘周期數(bpm); T為絕對溫度(K); Ea為活化能與R為前因子均在該公式中被認為常數。

對溫度與心率進行變換后, 利用Excel 2013和SPSS20.0 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對數據進行作圖與分析。使用Excel的線性回歸分析功能對每個皺紋盤鮑個體心率值上升與下降階段進行直線擬合, 繼而求出交點溫度ABT指標。利用獨立樣本t檢驗方法分析兩個群體間的ABT指標顯著性差異,顯著性差異表示為P＜0.05。為分析皺紋盤鮑體尺及個體質量性狀對心率ABT指標的影響, 對不同個體的生長性狀與ABT指標進行相關分析并計算Pearson相關系數分析, 顯著相關表示為P＜0.05。

2 結果

兩個皺紋盤鮑群體17個個體均獲得有效心率測定結果。圖1為個體心率隨溫度變化示意圖, 可以看出不同溫度下心率周期的明顯差異。圖2為高溫耐性和對照群體中的各一個個體心率變化曲線的直線擬合, 通過該直線擬合獲得該個體的ABT指標。表1為34個個體心率測定結果與生長性狀測定結果(部分個體因死亡未記錄)。計算獲得兩個群體的平均ABT指標, 高溫耐性群體為(28.18±0.45)℃; 對照群體為(27.75±0.56)℃。經t檢驗, 兩個群體的ABT存在顯著性差異, 高溫耐性組皺紋盤鮑的ABT顯著高于對照組, P為0.019。分析檢測個體的生長性狀與ABT的關系, 發現只有殼高與ABT呈顯著相關, 相關系數為0.370, P為0.048。

圖1 心率變化示意圖Fig. 1 Variation in cardiac response to thermal stress in Pacific abalone

圖2 ABT計算示意圖Fig. 2 ABT calculation method

表1 高溫耐性與對照群體皺紋盤鮑ABT(℃)與生長性狀Tab. 1 ABT and growth traits of resistant and contrast abalones

3 討論

3.1 皺紋盤鮑ABT指標的可行性分析

ABT指標在濱螺、帽貝和貽貝中已有廣泛研究。這些貝類大多都是潮間帶生物, 它們多具有廣溫性的特點, 有利于ABT指標的測定。以帽貝為例, 溫度適宜范圍從4～50℃, 且不同物種之間的差異明顯,相差可達5℃以上。ABT指標對于帽貝而言, 不僅可以衡量其高溫耐受程度, 更可作為一個環境監測指標反映不同種帽貝所處環境條件的差異[20]。雖然皺紋盤鮑不具備廣溫性, 但本實驗證明了該方法在皺紋盤鮑中的可行性。首先, 兩個群體的ABT指標的標準差均不高說明ABT指標的組內個體間差異不大。其次, 高溫耐性組ABT顯著高于對照組, 因此用于比較兩個群體的高溫耐受程度是科學可行的。值得注意的是一齡個體是最適合開展心率測定的,由于一齡個體體積較小(平均殼長為40 mm), 心臟對應位置殼表面積小于紅外探頭截面(4 mm×5 mm),可以快速穩定獲得心率信號。而藍丁膠的粘貼需要將鮑魚殼表面擦干以增加粘貼時長, 一齡個體有利于縮短捕獲心率的時間。所以一齡個體更適合進行心率測定實驗。通過紅外探頭粘貼在鮑魚殼表面以檢測心率的方法也是皺紋盤鮑的生長指標中只有殼高與心率存在顯著相關的主要原因, 殼高會直接影響到心率信號的獲取。

開展心率測定的時間是影響實驗的重要因素。皺紋盤鮑的最適生長溫度范圍是10～22℃[21], 監測皺紋盤鮑心率的起始溫度必須在該溫度范圍內, 且起始溫度越低越好。因為計算ABT指標過程中, 心率隨溫度上升而上升的階段越長, 趨勢線的計算越準確。所以在水溫低的時候, 如11月至2月, 是進行心率測定的最佳時間。測定心率時還應注意實驗時長的控制, 本實驗每個個體的心率測定時間均控制在2 h以內, 畢竟是在水浴條件內進行實驗, 并且還會出現超過ABT后的心率驟降現象, 作為一種非損傷性的檢測方法, 實驗動物的存活是也關鍵的考量。雖然本實驗有部分個體在測定心率后出現了死亡,但相比傳統的表型記錄為生存與否以評估高溫耐受程度的方法, 已經大幅提高了實驗動物的存活率。

然而并非所有貝類生物都適用這一方法。本實驗室亦用這一方法對長牡蠣(Crassostrea gigas)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)進行心率測定。結果扇貝可以得到有效結果, 而牡蠣難以得到有效的心率信號, 可能與牡蠣表面粗糙有關。

3.2 皺紋盤鮑ABT指標的實際應用

本實驗選取的是兩個來源清晰, 能夠區分高溫抗性與對照的群體進行ABT指標的測定。結果與實際相符不僅說明了方法的可行性, 也為該方法作為比較群體或家系的高溫耐受程度的標準提供可能。很多品系的皺紋盤鮑經過雜交育種后, 品質得到改良[22-23], 但高溫耐受能力作為存活率的關鍵指標卻無法合理科學的量化。心率測定ABT指標的方法有效的改善這一問題, 比較多個家系間皺紋盤鮑的ABT指標就可以比較這些家系的高溫耐受程度, 以此作為一種篩選手段, 亦可作為育種值, 針對高溫耐性進行選育。該方法不僅快速有效, 還對實驗動物具有較低致死性, 可以解決傳統的脅迫致死檢測法對一些珍貴的家系無法測定高溫耐受能力的困擾。

目前主要養殖海區的水溫監測系統已經開始使用, 結合皺紋盤鮑ABT指標的推廣, 可以在海水溫度迫近養殖鮑魚耐受臨界溫度時及時調整養殖活動,降低皺紋盤鮑出現嚴重的度夏死亡的風險。

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Received: Feb.10, 2016

Variation in cardiac response to thermal stress in two different cultured populations of Pacific abalones

LIN Si-heng1,2,3,4, WU Fu-cun1,3,4, ZHANG Guo-fan1,3,4
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 7 Nanhai Road, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 4. National & Local Joint Engineering Laboratory of Ecological Mariculture, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Haliotis discus hannai; measuring heart rate; thermal stress; Arrhenius break temperatures

High water temperature is one of the most important reasons for the low summer survival rate of Pacific abalones (Haliotis discus hannai). The temperature that induces cardiac failure in abalone is known as the Arrhenius break temperature (ABT). Survival indicators of Pacific abalones can be obtained by measuring their heart rate. In this study, heart rates were measured using a non-invasive method. We then obtained ABTs as biomarkers and used them to determine the heat resistance of abalones with high accuracy and speed. Abalone heart rates rose as the temperature increased and then dropped abruptly. In this study, we measured the heart rate in 17 resistant abalones and 17 contrast abalones from two different groups. The results indicate that the ABT of the resistant abalones seemed higher (P＜0.05) than that of the contrast abalones. In addition, there was a significant (P＜0.05) positive correlation between abalone shell height and ABT. For the first time, we determined the heat resistance of Pacific abalones by measuring heart rate and verified the feasibility of the method.

S917.4

A

1000-3096(2016)11-0084-07

10.11759/hykx20160328003

(本文編輯: 梁德海)

2016-02-10;

2016-04-08

國家自然科學基金項目(31302184); 貝類產業技術體系項目(CARS-48); 泰山攀登計劃項目

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 31302184; The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-48); Taishan Scholars Climbing Program of Shandong]

林思恒(1991-), 男, 福建廈門人, 碩士研究生, 研究方向:海洋貝類遺傳育種, E-mail: linsiheng@qq.com; 張國范, 通信作者,研究員, 博士研究生導師, E-mail: gfzhang@qdio.ac.cn