熱穩定κ-卡拉膠酶產生菌Bacillus sp.Car19的發酵條件優化

謝買勝, 李 江, 林學政, 何培青

(國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

熱穩定κ-卡拉膠酶產生菌Bacillus sp.Car19的發酵條件優化

謝買勝, 李 江, 林學政, 何培青

(國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

對一株分泌熱穩定κ-卡拉膠酶印尼熱泉菌進行了種屬鑒定, 并采用響應面法對該菌發酵產酶條件進行了優化。鑒定結果表明, 該菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus), 命名為Bacillus sp.Car19(GeneBank: KT865196)。發酵條件優化結果顯示, 9個環境因子影響Bacillus sp.Car19產酶量。其中影響Bacillus sp.Car19產酶量的三個主要因素分別為培養溫度、培養基中Cu2+濃度和培養基中NaCl濃度。綜合次要因素對Bacillus sp.Car19產酶影響, Bacillus sp.Car19最佳產酶發酵條件為: 培養溫度52.31℃、Cu2+濃度6.93 mmol/L、NaCl濃度37.03 g/L, 培養基pH為6, 接種量1%, 培養時間36 h, 半乳糖濃度0.3 g/L,硝酸銨濃度7 g/L, 卡拉膠濃度0.5 g/L。優化后發酵上清液酶活力達到15.21 U/mL, 與優化前相比提高了1.5倍。

熱泉菌; 卡拉膠酶; 優化; 響應面

嗜熱微生物由于能合成多種具有應用價值的耐熱酶, 已成為近年來科學研究的熱點[1]。微生物學家們普遍認為, 能在55℃以上高溫環境生長的微生物為嗜熱微生物, 包括最低等的古細菌和部分細菌,能在80℃以上環境中生長的為極端嗜熱菌, 其中大部分是古細菌[2]。耐熱酶是嗜熱微生物產生的一類熱穩定性酶, 這種酶特點就是在高溫下達到最高催化效率。高溫能提高底物和產物的溶解度, 減少物質與反應器的貼壁效應, 同時降低染菌風險, 減少產物收集難度, 所以耐熱酶有望取代傳統常溫催化, 廣泛用于食品、生物制藥、廢水處理等生產領域[3-4]。

卡拉膠(carrageenan)是海洋紅藻中一種結構性多糖, 由α-1, 3和β-1, 4糖苷鍵交替連接的D-半乳糖或其衍生物組成。它是一種親水性膠體, 主要存在于海藻細胞壁中[5]。常見的卡拉膠有κ-, λ-, ι-型, 另外也有α-, β-, θ-, μ-, ν-, γ-, δ-, ξ-, π-, ω-等類型的卡拉膠。卡拉膠的分子質量大、溶解性差、機體不易吸收、利用率低等缺點, 制約了卡拉膠在醫藥領域的應用[6], 目前卡拉膠主要用于食品相關工業。已有的研究結果表明: 利用卡拉膠制備的卡拉膠寡糖具有多種生物活性, 如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調節等[7-9], 因此在醫藥領域有很高應用價值。如何利用卡拉膠制備卡拉膠寡糖, 提升卡拉膠的應用價值已成為當前卡拉膠研究亟需攻克的技術。制備卡拉膠寡糖的方法主要有三種: 生物酶法、化學法及物理法。傳統的化學法和物理法的主要缺陷是反應條件不易控制、產物聚合度很高且分布不均一。利用卡拉膠酶制備卡拉膠寡糖的生物酶法, 具有反應條件溫和易控制、底物專一性好等優點, 能克服物理法和化學法的缺陷。因此利用生物酶法, 開發高活性的卡拉膠酶是提升卡拉膠應用價值的關鍵技術。

卡拉膠酶是能斷裂卡拉膠β-1, 4糖苷鍵的半乳糖苷水解酶。根據底物類型, 可以分為 κ-, ι-, λ-卡拉膠酶[10]。迄今發現的卡拉膠酶大部分為熱不穩定酶,當溫度高于60℃時就會迅速失活, 嚴重限制了卡拉膠酶的應用。牟海津[11]研究表明, 卡拉膠降解菌M-2分泌的κ-卡拉膠酶在55℃放置30 min 即喪失全部酶活; Potin等[12]研究顯示, Cytophaga菌株分泌的κ-卡拉膠酶在40℃放置1 h, 酶活亦完全喪失。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、耐熱性好等優點, 是生物工程領域具有發展前景的酶資源。本研究以一株分泌熱穩定卡拉膠酶的印尼熱泉菌為對象, 通過16S rDNA測序的方法鑒定了該菌的種屬,用響應面法確定了該菌的最適產酶發酵條件, 以期為生物酶法制備卡拉膠寡糖及卡拉膠寡糖的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

產卡拉膠酶的菌株分離自印度尼西亞卡利安達島東海岸的熱泉樣品(5°44′46″N, 105°35′12″E), 現保存于國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室菌種庫中(-80)℃。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉(Oxoid公司); 分析純κ-、λ-、ι-卡拉膠(SIGMA公司); 混合卡拉膠(天津巴斯夫化工有限公司); 3-5二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、結晶酚、碘單質、碘化鉀、亞硫酸鈉、四水合酒石酸鉀鈉和甘氨酸均為國產分析純。

1.1.3 培養基

2216E液體培養: 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 1000 mL過濾海水配制;

2216E固體培養基: 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 卡拉膠15g, 1000 mL過濾海水配制;

2216E斜面培養基: 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 瓊脂粉 15g, 1000 mL過濾海水配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA的鑒定

以Bacillus sp.Car19菌株基因組為DNA模板,利用通用引物27F、1492R[13]對Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA基因進行PCR擴增, 使用3730測序儀對PCR產物進行序列測序并雙向測通(南京金斯瑞生物公司)。將所測序列在GenBank數據庫(NCBI)用BLAST分析比對并上傳序列獲得GenBank登錄號。

1.2.2 Bacillus sp.Car19產卡拉膠酶的類型的確定

以2216E固體培養基作為基礎培養基, 分別加入κ-, λ-, ι-卡拉膠制成篩選平板, 取2 μL含Bacillus sp.Car19的菌液于平板上, 在55℃恒溫培養箱中倒置培養36 h, 然后用Lugol氏碘液染色, 觀察菌落周圍是否有透明圈, 以確定該菌產生的卡拉膠酶的類型。

1.2.3 卡拉膠酶活力的測定方法-DNS法[14]

前期實驗表明, Bacillus sp.Car19發酵上清液中粗酶的最適作用條件為60℃、pH=9, 因此, 本次實驗取1mL培養36h后的發酵上清液作為粗酶液, 與1mL 0.5%的卡拉膠在60℃、pH=9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中反應15min后, 測量反應體系中還原糖的含量來表示粗酶的酶活。1個酶活力單位(U)定義為1mL發酵上清液在60℃和pH為9的條件下, 1min內催化產生1μg還原糖所需的酶量。酶活力計算公式[15]:

1.3 Bacillus sp.Car19的發酵條件優化

1.3.1 單因素實驗

分別以培養溫度、培養基pH、培養時間、接種量、不同碳源、不同氮源、最適碳源濃度、最適氮源濃度、不同金屬離子、最適金屬離子濃度、卡拉膠濃度及NaCl濃度作為唯一變量, 進行發酵實驗,確定各種環境因素對Bacillus sp.Car19產酶的影響。各因素及水平見表1。以發酵液在波長600 nm下的吸光度代表其生物量, 離心發酵上清液酶活力最高時條件為單因素實驗下最適產酶條件, 并將該條件下酶活力定義為100%。分別確定影響Bacillus sp.Car19產酶的最適培養溫度、最適培養基pH、最適培養時間、最適接種量、最適碳源、最適氮源、最適碳源濃度、最適氮源濃度、最適金屬離子、最適金屬離子濃度、最適NaCl濃度以及卡拉膠濃度。其中, 確定最適碳源、氮源、金屬離子后, 進一步設置不同濃度梯度找出最適碳源、氮源、金屬離子的最適濃度。

1.3.2 響應面法優化Bacillus sp. Car19發酵條件

1.3.2.1 Plackett-Burman實驗[16]

根據單因素的實驗結果, 對上述9個因素進一步考察, 采用Factors=9, Runs=12的Plackett-Burman設計, 選取各因素最高和最低2個水平, 進行50 mL發酵實驗, 用每毫升發酵上清液中卡拉膠酶活力表示響應值R1, 確定影響Bacillus sp. Car19發酵產酶的主要因素, 實驗因素代碼(實驗因素對應代碼全文不變)及水平見表2。

1.3.2.2 最陡爬坡實驗[17]

據Plackett-Burman 實驗結果, 利用Designexpert.v8.05軟件進行各因素的方差分析, 得到各因素重要性排名順序, 對排名前三的實驗因素, 選擇適合的坡度進行梯度實驗, 得到發酵上清酶活力逼近最大響應面區域時的條件。

表1 單因素實驗設計各因素及水平Tab. 1 Factors and levels in single factor experiment

表2 Plackett-Burman實驗中影響Bacillus sp.Car19產酶的因素及水平Tab. 2 Factors and levels affecting Bacillus sp. Car19 production of carrageenase in Plackett-Burman experiment

1.3.2.3 響應面Box-Behnken實驗設計[18]

利用Design-expert.v8.05軟件中Box-Benhnken設計響應面實驗, 考察三個顯著因素之間的交互作用及獲得發酵上清液酶活力最高時的三因素組合。各因素代碼及水平見表3, 其中以最陡爬坡實驗中酶活力最高時的實驗條件, 作為Box-Benhnken實驗設計的中心點, 圍繞中心點附近取一個最高和最低水平, 進行15個不同條件組合的發酵實驗。

表3 Box-Behnken實驗因素及水平Tab. 3 Box-Behnken factors and level values

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA經測序拼接后長度為1461 bp, 與NCBI數據庫中Bacillus licheniformis DHXJ13菌株16S rDNA基因的相似度為99%, 因此確定該熱泉菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus), 命名為Bacillus sp.Car19。將該序列上傳至NCBI數據庫, 獲得GenBank登錄號為(KT865196), 根據 Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA構建的系統發育樹如圖1所示。

圖1 根據Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 1 Neighbor-joining tree of Bacillus sp.Car19 based on 16S rDNA gene sequence

2.2 Bacillus sp.Car19所產卡拉膠酶的類型

Bacillus sp.Car19在含有不同類型卡拉膠的篩選平板生長36 h后, 只在含有κ-卡拉膠的篩選平板上產生明顯的透明圈(圖2), 而在其他類型卡拉膠的平板上沒有透明圈(圖略), 因此確定該酶為κ-卡拉膠酶。

圖2 Bacillus sp.Car19在κ-卡拉膠平板上產生的透明圈Fig. 2 Bacillus sp. Car19 produced transparent circle on Kappa-carragenan solid medium

2.3 單因素實驗結果

各種環境因素對Bacillus sp.Car19生長及產酶的影響情況見圖3。由(圖3-a)可以看出該菌在60℃時生物量達到最大值, 但相對酶活力在培養溫度為50℃時最高; pH對菌體生長及產酶影響較小, 菌體在培養基pH=6時相對酶活力最高(圖3-b); (圖3-c)的結果表明最高酶活力出現在培養36 h時, 但菌的生物量還在繼續增加, 直到48 h后才開始降低; 接種量在0.5%～1%(圖3-d)之間時, 發酵上清液粗酶的酶活力保持增加趨勢, 但接種量超過1%后, 發酵上清液粗酶酶活力開始降低, 但接種量過小, 菌體培養時間就會相對延長[19]。同時研究結果也表明, 最佳碳源為0.3 g/L的半乳糖(圖3-e和圖3-g), 最佳氮源為7 g/L的硝酸銨(圖3-f和圖3-h), 培養基中卡拉膠最佳濃度則為0.5 g/L(圖3-k); 金屬離子對菌體生長及產酶有較明顯的影響, 特別是培養基中Cu2+濃度為5 mmol/L(圖3-j)以及NaCl濃度為30 g/L時(圖3-l)。

2.4 響應面實驗結果

2.4.1 Plackett-Burman 實驗結果

Plackett-Burman 實驗結果見表4。從表4中可以看出: 進行12個不同因素最高最低水平組合的實驗時, 發酵上清液最高酶活力為15.08 U/mL, 最低為9.35 U/mL。且不同條件組合下, 發酵液上清酶活力在9～12 U/mL之間比較集中。同時對實驗結果進行F檢驗, 結果見表5, 從表5中可以看出影響Bacillus sp.Car19產酶的三個重要的因素依次是培養溫度, 培養基中Cu2+含量, NaCl濃度, P值均小于0.05, 說明這 3 個因素對 Bacillus sp.Car19產酶活力影響顯著, 因此選擇這 3 個因子作為最陡爬坡實驗進一步考察影響Bacillus sp.Car19產酶量的對象。

圖3 不同培養條件對Bacillus sp. Car19生長及產卡拉膠酶的影響Fig. 3 Influence of different culture conditions on Bacillus sp. Car19 growth and carrageenase production

2.4.2 最陡爬坡實驗結果

根據 Plackett-Burman 實驗各因素重要性的排列順序, 選出影響Bacillus sp.Car19產酶前三的因素進行梯度爬坡實驗, 實驗結果見表6。從表中可以看出在培養溫度為54℃、Cu2+7 mmol/L、NaCl濃度36 g/L時發酵上清液的酶活力達到最大值15.07 U/mL, 因此將該條件作為下一步Box-Behnken響應面設計實驗的中心點。

2.4.3 響應面Box-Behnken法獲得最優發酵條件結果

以最陡爬坡實驗得到的發酵上清酶活力最高實驗條件為中心值, 分別取離中心值附近的各對稱條件為最高最低水平, 采用factors=3, run=15進行Box-Behnken響應面實驗設計, 實驗設計及結果見表7。對實驗結果進行二次多元回歸方差分析, 得到發酵上清液酶活力R1與自變量培養溫度X1、Cu2+濃度X7、NaCl濃度X8的的多元回歸方程為:

R1=12.47+2.61X1+2.67X7+2.86X8-0.24X1X7+2.48 X1X8+1.42X7X8-2.03X12-2.14X72-2.90X82

回歸模型方差分析見表8。從表中可以看出模型P=0.0401小于0.05, 說明線性模型回歸顯著, 模擬得到的方程可信。X1、X7、X8的P值均小于0.05, 對Bacillus sp.Car19產酶影響顯著, 交互項和二次項的中X1X8、X82的P值小于0.05, 說明Bacillus sp.Car19卡拉膠酶產量受三因素之間交互作用的影響。決定系數R2=0. 9056, 失擬項CV=27.04%, 表明模型與實驗擬合較好, 得到的方程可用。因此通過多元回歸得到的方程可以很好的說明Bacillus sp.Car19產酶量與培養溫度X1、Cu2+濃度X7、NaCl濃度X8之間的關系。

表4 Plackett-Burman實驗設計及響應值結果Tab. 4 Plackett-Burman design and response results

表5 Plackett-Burman實驗主效應分析Tab. 5 Analysis of main effects of Plackett-Burman design

表6 最陡爬坡實驗設計及結果Tab. 6 Experimental design and response of steepest ascent

根據多元回歸方程(1)繪制的培養溫度、Cu2+濃度、NaCl濃度兩兩交互作用的響應曲面及等高線見圖4～圖6。從響應曲面圖可以看出發酵上清液酶活R1的值在所選因素范圍內有最大值, 最大值即為等高面圖的中心點。為求出多元回歸方程(1)所構建模型的最大值及最大值條件下對應各因素的組合, 對所得的回歸擬合方程分別求各自變量的一階偏導數, 并令其為0, 得到三元一次方程組, 求解此方程組得到模型R1在最大值條件下各因素對應的值[20]: X1=52.31、X7=6.93、X8=37.03, 即當培養溫度為52.31℃、Cu2+濃度為6.93 mmol/L、NaCl濃度為37.03 g/L時, 理論發酵上清液酶活力R1的最大值為15.82 U/mL。為進一步驗證模型是否正確, 進行三組發酵實驗驗證, 每組培養基均為優化后得到的最優條件, 用三組數據平均值來表示優化后發酵上清液的酶活力。測得優化后發酵上清液酶活力R1=15.21 U/mL, 接近預測值,表明優化得到的發酵條件可信。發酵后的酶活力是未優化前的1.5倍, 優化后的培養基提高了Bacillus sp. Car19 的產酶量。

表7 Box-Behnken實驗設計及結果Tab. 7 Box-Behnken design and results

表8 回歸方程方差分析Tab. 8 Analysis of variance by regression equation

圖4 NaCl濃度和培養溫度影響Bacillus sp. Car19產卡拉膠酶繪制的響應曲面及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plot of NaCl concentration and temperature influence on Bacillus sp. Car19 carrageenase production

圖5 Cu2+濃度和培養溫度影響Bacillus sp. Car19產卡拉膠酶繪制的響應曲面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plot of Cu2+concentration and temperature influence Bacillus sp. Car19 carrageenase production

圖6 NaCl濃度和Cu2+濃度影響Bacillus sp. Car19產卡拉膠酶繪制的響應曲面及等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plot of NaCl concentration and Cu2+concentration influence on Bacillus sp. Car19 carrageenase production

3 討論

自從1966年首次在海洋微生物中發現能分泌卡拉膠酶的假單胞菌 Pseudomonas carrageenovora[21]以來, 已發現多種屬的海洋微生物能產生卡拉膠酶,如噬纖維菌屬、假單胞菌屬、別單胞菌屬、弧菌屬等[22], 這些細菌多分離自海藻表面或以海藻為食的軟體動物, 且多為熱不穩定酶。本文研究的產酶菌株分離自印度尼西亞卡利安達島東海岸的熱泉群(5°44′46″N, 105°35′12″E), 熱泉水溫可達50～97℃[1],周邊毗鄰大型海藻床, 經鑒定該菌屬于Bacillus屬,與胡秋實等[23]發現的產卡拉膠酶菌株一致, 但前者為λ-卡拉膠降解菌, 而本研究中的菌株為κ-卡拉膠降解菌, 目前有關熱泉菌產卡拉膠酶的報道尚不多見。

培養條件的優化在微生物代謝產物的研究中起著重要的作用, 與傳統的單次單因子法和正交實驗相比, 響應面法實驗次數少、周期短, 不僅能夠評價各因素對生物過程的影響, 并且還能體現各因素之間的交互作用得到最佳條件, 是優化培養條件的有效方法[24]。為了提高Bacillus sp. Car19產卡拉膠酶的能力, 本文采用響應面法對其培養條件經行了優化, 發現影響Bacillus sp. Car19產卡拉膠酶的三個主要因素分別為培養溫度、NaCl濃度和Cu2+濃度。培養溫度是微生物生長和代謝的關鍵因素, 由于Bacillus sp. Car19來源于熱泉, 因此較高的培養溫度也與其生長環境相一致, 較高的培養溫度不僅能夠縮短培養周期, 而且也可有效的避免雜菌的生長;李俊等[19]對HC4菌株產卡拉膠酶條件優化時發現, NaCl濃度對其產卡拉膠酶能力有較大影響, 且NaCl的最適濃度在20 g/L左右, 而本研究中NaCl濃度達到37.03g/L, 比普通海水的濃度略高; 至于Cu2+濃度對產酶能力的影響機制目前尚不清楚, 有待今后結合熱泉樣品的組成成分進行綜合分析。

經過優化后, 發酵上清液的酶活力達到15.21 U /mL,比優化前提高了1.5倍, 加之Bacillus sp. Car19所產的卡拉膠酶作用溫度高, 在后續制備產物的過程中雜菌很難生存, 能減少雜菌代謝物對產物的污染,同時減少物質的貼壁效應, 使得收集卡拉膠寡糖相對容易, 因而具有一定的應用潛力。

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Received: Jan. 25, 2016

Optimization of fermentation conditions for thermostable κ-carrageenase production of strain Bacillus sp. Car19

XIE Mai-sheng, LI Jiang, LIN Xue-zheng, HE Pei-qing
(First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China)

Hot spring bacterium; Carrageenase; Optimization; Response surface

In this study, we identified a high-yield κ-carrageenase bacteria strain by its 16S rDNA sequence and optimized the fermentation conditions using a response surface methodology. The results show that the hot-spring bacterium was 99% identical to Bacillus sp. and therefore we assigned it to the Bacillus genus and named it Bacillus sp. Car19 (GenBank accession number: KT865196). The optimized fermentation conditions of Bacillus sp. Car19 involve nine factors that affect Bacillus sp. Car19 carrageenase production, and the three main factors are culture temperature, Cu2+concentration, and NaCl concentration. Combined with subordinate factors, the final optimized fermentation conditions for maximal activity, as determined by regression analysis are as follows: a culture temperature of 52.31℃, a Cu2+concentration of 6.93 mmol/L, an NaCl concentration of 37.03 g/L, medium pH = 6, 1% inoculation quantity, 36 h incubation time, a galactose concentration of 0.3 g/L, an ammonium nitrate concentration of 7 g/L, and a carrageenan concentration of 0.5 g/L. The supernatant carrageenase activity after optimized fermentation can reach 15.82 U/mL, which is 1.5 times that without optimization.

Q178.53

A

1000-3096(2016)11-0007-10

10.11759/hykx20160125001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-01-25;

2016-04-26

海洋公益性行業科研專項項目(201505026); 青島市應用基礎研究計劃項目(14-2-4-14-jch); 國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室開放基金(MBSMAT-2015-06)

[Foundation: Public Science and Technology Research Funds Project of Ocean (201505026); Qingdao Fundamental and Applied Research Project (14-2-4-14-jch); Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique, SOA (MBSMAT-2015-06)]

謝買勝(1992-), 男, 江西九江人, 碩士研究生, 研究方向:極地微生物學, E-mail: 903741992 @qq.com 電話: 13127057267; 李江, 通信作者, 副研究員, 博士, 研究方向: 極端微生物環境適應性及其活性物質研究, Email: lijiang@fio.org.cn