黃顙魚“紅頭病”病原菌蠟狀芽孢桿菌分離鑒定及藥敏分析

胡宗云，宋文華，張濤，富麗靜，李赫，姚福向，楊培民

（遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動物病害防治重點實驗室，遼寧 遼陽 111000）

黃顙魚“紅頭病”病原菌蠟狀芽孢桿菌分離鑒定及藥敏分析

胡宗云，宋文華，張濤，富麗靜，李赫，姚福向，楊培民

（遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動物病害防治重點實驗室，遼寧 遼陽 111000）

從患“紅頭病”黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco的肝、腎等組織中分離出致病菌，通過人工感染試驗、生化鑒定及16SrRNA序列分析進行鑒定，采用K-B瓊脂法進行藥敏試驗。結(jié)果表明：分離獲得的優(yōu)勢菌株HHG有很強的致病性，鑒定為芽孢桿菌Bacillus cereus；該菌株對丁胺卡那、米諾環(huán)素、恩諾沙星3種抗生素高度敏感；對中慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢哌酮等10種抗生素中度敏感，對頭孢曲松、利福平和鏈霉素3種抗生素低度敏感，而對青霉素、苯唑西林、氨芐西林等14種抗生素具有耐藥性。本研究結(jié)果可為有效防控黃顙魚“紅頭病”提供參考。

黃顙魚；紅頭病；蠟狀芽孢桿菌；分離;鑒定；藥敏分析

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco肉質(zhì)細嫩，無肌間刺，多脂肪，蛋白質(zhì)含量為15.37%，脂肪為16.1%，17種氨基酸總量達14.79%，具有極高的營養(yǎng)價值[1]。黃顙魚肉性味甘、平，有祛風(fēng)、利尿之功效，有一定的藥用價值，深受消費者的青睞。近幾年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大和養(yǎng)殖密度提高，黃顙魚出現(xiàn)了各種各樣的疾病，如病毒病、細菌病和寄生蟲病，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2-4]。近年來，遼寧、湖北、浙江、四川等地養(yǎng)殖的黃顙魚暴發(fā)了一種稱為“紅頭病”的流行病，又稱為“紅腦門病”、“裂頭病”，主要癥狀為：病魚頭朝上尾朝下在水面間歇性螺旋狀轉(zhuǎn)悠；腹部膨大，鰭條基部、口腔、下頜、鰓蓋、眼眶充血，頭頂正中部位皮下發(fā)紅，嚴重時頭骨裂開，在頭頂部出現(xiàn)一條狹長的潰爛出血帶，呈現(xiàn)典型的“紅頭病”癥狀；解剖腹腔，內(nèi)有少量血水或透明腹水，肝臟有點狀或塊狀出血，膽腫大呈紫黑色，胃、腸道發(fā)白，腸內(nèi)無食。該病在每年的4～6月和9～10月流行，主要危害25～100g的黃顙魚種或成魚，傳染性強，發(fā)病感染率可達10%～30%，死亡率高達70%，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。為研究黃顙魚“紅頭病”的病因，科學(xué)防控黃顙魚的“紅頭病”，本文開展該病的病原分離、純化、鑒定及藥敏試驗工作。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病魚取自遼寧省燈塔市忠信集團的黃顙魚養(yǎng)殖基地，用于人工感染的健康魚購自遼寧省燈塔市良波漁場。發(fā)病魚與健康魚大小相近，體長12～15cm，體質(zhì)量35～45g。

1.2 方法

1.2.1 患病魚的細菌分離

取典型患“紅頭病”黃顙魚，用75%酒精消毒體表后，按照無菌操作的方法，用滅菌手術(shù)剪剪開其頭部及腹部，觀察腦及內(nèi)臟的感染情況，未見寄生蟲；分別取腦、肝臟、腎臟、鰓及腹水，勻漿后接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28℃恒溫培養(yǎng)48h后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌（編號HHG），進行分離純化、保種。

1.2.2 人工感染試驗

在水溫（24±2）℃下，將健康黃顙魚在50cm× 38cm×30cm的水族箱中暫養(yǎng)7d，定期投喂配合飼料，及時清污，日換水量1/3。將分離純化的菌株HHG在普通營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24h后，用滅菌的10號針頭腹腔注射于健康黃顙體內(nèi)，菌液0.1mL，濃度為105CFU/mL，每日換水1/3；對照組采用相同方式注射相同體積的液體培養(yǎng)基，日常管理同試驗組。連續(xù)觀察、記錄其發(fā)病癥狀，取發(fā)病魚的肝臟、腎臟、鰓及腹水進行病原菌的再分離、鑒定。

1.2.3 細菌的鑒定

1.2.3.1 細菌的菌落形態(tài)及細菌大小、形狀觀察

取試驗用菌株劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征。常規(guī)生理生化特征參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]進行常規(guī)鑒定。

1.2.3.2 生理生化鑒定

采用API/ATB半自動化細菌分析儀鑒定，將HHG菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h后挑取菌落混于生理鹽水中，用API/ATB光電比濁儀測量配成0.5mol/L McFarland的菌懸液。吸取菌懸液接種ID32E測試卡（55μL/孔），置于35℃培養(yǎng)箱孵育24h。取出測試卡置閱讀器上檢測反應(yīng)結(jié)果，并轉(zhuǎn)換為能被計算機接受的反應(yīng)編碼，最后由計算機判定鑒定結(jié)果。

1.2.3.3 細菌16SrDNA的鑒定

將分離純化的菌株直接送到上海生工測序公司，用細菌通用引物擴增、純化，測定細菌的16S rDNA序列，將測得的菌株16S rDNA序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，同時從Genbank下載芽孢桿菌屬多個序列利用MEGA4.1軟件包進行序列比對，并采用鄰接法（Neighbor-joining method）分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 藥物敏感性試驗

待測菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗下，制成108CFU/mL的菌懸液，取0.1mL涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，將藥敏紙片（杭州微生物有限公司生產(chǎn)）貼于該培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈的大小，進行敏感性判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的菌落特征

從病魚的腦組織勻漿液涂布的培養(yǎng)基中未見有細菌長出，而在肝臟、腎臟、鰓及腹水等組織的普通營養(yǎng)瓊脂平板中可見大量形態(tài)特征均一致的圓形或近圓形菌落，菌落直徑5～7mm，邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀，質(zhì)地軟，無色素，呈稍有光澤的白色。在血平板上，菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環(huán)。在顯微鏡的油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細菌呈桿狀，末端方，成短或長鏈，大小為（1.0～1.2）×（3.0～5.0）μm；產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生；革蘭氏染色陽性，無莢膜，具運動性。

2.2 病原菌的人工感染

將菌株HHG感染健康黃顙魚72h后，發(fā)病早期頭頂凹陷處出現(xiàn)“線狀”淺紅色充血帶（圖1-2），隨病情加重，后期凹陷處腫脹甚至潰爛，與自然感染癥狀基本一致（圖1-1）；從發(fā)病的肝、腎等組織中再次分離到與實驗菌株HHG形態(tài)特征、理化性質(zhì)完全一致的菌株，表明分離菌株是黃顙魚“紅頭病”的病原菌。

2.3 細菌的生理生化特征

菌株HHG生理生化特征經(jīng)梅里埃ID 32E試劑條鑒定結(jié)果表明，菌株HHG隸屬于芽孢桿菌屬Bacillus sp.（表1）。

圖1 黃顙魚自然發(fā)病和攻毒試驗后的癥狀Fig.1 Symptoms of red-head disease in pond-cultured yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco and in HHG-infected individual

表1 菌株HHG生理生化特征Tab.1 The physiological and biochemical characterization of HHG

2.4 細菌的16S rDNA序列分析

菌株HHG的16S rDNA大小為1 450bp，輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果顯示與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus的16S rDNA聚為一類，序列同源性達到99%。結(jié)合細菌形狀大小及生理生化特征，菌株 HHG鑒定為蠟狀芽孢桿菌 Bacillus cereus，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 菌株HHG 16S rDNA序列與其他細菌親緣關(guān)系及進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain HHG and its closest relatives based on 16S rDNA sequence

2.5 菌株HHG對不同藥物的敏感性

菌株HHG對30種常見抗生素中的丁胺卡那、米諾環(huán)素、恩諾沙星3種抗生素高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢哌酮等10種抗生素中度敏感；對頭孢曲松、利福平和鏈霉素3種抗生素低度敏感；而對青霉素、苯唑西林、氨芐西林等14種抗生素具有耐藥性（表2）。

3 討論

黃顙魚“紅頭病”在我國各養(yǎng)殖區(qū)均有發(fā)生，每年給黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。黃顙魚“紅頭病”常由愛德華氏菌感染引起，比如遲鈍愛德華氏菌Edwarsiella tarda[6,7]、鲇愛德華氏菌Edwardsiella ictarda[8]和鮰愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri[9]。與上述報道不同，本文通過對從具有“紅頭病”典型癥狀的黃顙魚體內(nèi)分離的致病菌HHG的形態(tài)觀察、生理生化試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株屬性與芽孢桿菌屬相近；經(jīng)16S rDNA序列克隆、測序比對分析表明：該菌株與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus序列高度一致（99%）。這表明黃顙魚“紅頭病”病原菌不局限于愛德華氏菌屬，病原具有多樣性的特點。蠟狀芽孢桿菌的分離和鑒定對黃顙魚“紅頭病”預(yù)防、快速檢測及治療具有重要意義。

表2 分離菌株對藥物的敏感性Tab.2 Sensitivities of the isolated strain to antibiotics

蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus能產(chǎn)生芽孢，對外界有害因子的抵抗力非常強，在自然界中分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多生熟食品中亦常見。蠟狀芽孢桿菌無毒菌株具有促進動物生長、提高免疫力以及預(yù)防疾病等優(yōu)點，已作為益生菌被廣泛用于飼料、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[10]；而有毒菌株具有致病性，可通過食物中毒引起人體腹瀉和嘔吐[11]，是一種食源性病原菌，該病菌也可引發(fā)出血病[12]、角膜炎[13]、急性眼內(nèi)炎[14,15]。在水產(chǎn)上，蠟狀芽孢桿菌可引發(fā)對蝦“黑鰓病”[16]、刺參“腐皮綜合征”[17]，也可造成軍曹魚[18]和羅非魚[19]大量死亡，而在患“紅頭病”的黃顙魚中分離出的致病性蠟狀芽孢桿菌尚屬首次。現(xiàn)有的研究表明，蠟狀芽孢桿菌是一種條件致病菌，其致病性受宿主和環(huán)境的綜合影響，隨著養(yǎng)殖密度增大，魚體棲息環(huán)境越來越惡劣，蠟狀芽孢桿菌很可能從機會致病菌成為常見病原體[19]。因此，養(yǎng)殖過程中要控制養(yǎng)殖密度，改善水體理化指標(biāo)，為黃顙魚生長提供良好水體環(huán)境；同時，在黃顙魚養(yǎng)殖中需慎用含有蠟狀芽孢桿菌的活菌制劑。

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Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogen Bacillus cereus from Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）with Red-head Disease

HU Zong-yun,SONG Wen-hua,ZHANG Tao,FU Li-jing,LI He,YAO Fu-xiang,YANG Pei-min
（Liaoning Key Laboratory for Prevention and Treatment of Aquatic Animal Diseases,Freshwater Fisheries Research Academy of Liaoning Province,Liaoyang 111000,China）

Pathogens were isolated from liver and kidney of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco with red-head disease,and identified by artificial infection test,biochemical system and 16S rRNA sequence analysis to investigate the cause of red-head disease in yellow catfish.In addition,a drug sensitivity test was carried out using K-B paper diffusion method.It was found that the superior strain HHG exhibited strong pathogenicity to yellow catfish and was identified as Bacillus cereus via biochemical identification and 16S rRNA sequence analysis.The superior strain was shown to be highly sensitive to 3 kinds of drugs including Amikacin,Minocycline and Enrofloxacin,moderately sensitive to 10 kinds of drugs including Gentamycin,Kanamycin,Neomycin and Cefoperazone,and slightly sensitive to 3 kinds of drugs like Ceftriaxone Sodium,Rifampicin and Strepolin.The superior strain,however,was resistant to 14 kinds of drugs including Penicillin,Ampicillin,Carbenicillin,and Piperacillin.The findings provide references with effectively prevent and control the red-head disease in yellow catfish.

Pelteobagrus fulvidraco;red-head disease;Bacillus cereus;isolation;identification;drug sensitivity test

S941

A

1005-3832（2016）04-0033-05

2016-03-19

遼寧省海洋與漁業(yè)廳項目（201302）.

胡宗云（1980-），女，工程師，從事水產(chǎn)動物病害防治研究.E-mail:huzongyun2004@163.com