利用CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚ifi30基因

曹頂臣，佟廣香，呂偉華，孫志鵬，匡友誼，鄭先虎，孫效文

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚ifi30基因

曹頂臣，佟廣香，呂偉華，孫志鵬，匡友誼，鄭先虎，孫效文

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用CRISPR/Cas9技術，在斑馬魚Danio rerio干擾素γ誘導蛋白30（ifi30）基因的第一個外顯子處選取靶位點，用PCR法構建gRNA，并進行體外轉錄。將體外轉錄的sgRNA和Cas9mRNA顯微注射到斑馬魚1細胞期的受精卵中，實現(xiàn)對靶基因ifi30的沉默。注射后24h檢測發(fā)現(xiàn)，基因突變率在79%～95%之間，平均突變率為87.2%。為了獲得穩(wěn)定遺傳的基因突變純合系，將F0代與野生型斑馬魚進行配組，獲得了3種突變類型的F1代，其突變率為30%。三種突變類型中突變1和突變2為移碼突變，突變3刪除了6個堿基，并未造成移碼。突變1和突變2的F1代雜合個體生長發(fā)育未見異常。將雜合F1代自交，理論上將獲得突變純合個體，但僅在受精2h以內的胚胎中檢測到了突變純合個體，受精24h后的胚胎中，只有野生型和雜合型，未見突變純合個體。推測ifi30基因的移碼突變造成了干擾素γ誘導蛋白的缺失，導致胚胎死亡。

斑馬魚；ifi30；CRISPR/Cas9技術；敲除

斑馬魚Danio rerio個體小、發(fā)育快、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、繁殖力強、體外受精、胚胎在母體外發(fā)育，且受精卵透明、易于操作，已成為常用的動物模型[1]，越來越多地被用于免疫相關研究中。干擾素γ誘導蛋白30（ifi30）作為一種可溶性的蛋白質，能夠在催化二硫鍵的還原，參與抗原呈遞和加工以及對機體病毒免疫、腫瘤免疫、寄生蟲抗原免疫應答產生影響，ifi30的缺失可能會對機體病毒免疫[2,3]、腫瘤免疫[4,5]、寄生蟲的抗原免疫應答造成影響，還可能引起自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展[6]。因此，研究ifi30基因突變對斑馬魚的影響，具有重要的意義。

CRISPR/Cas9技術[7-9]簡單、易行，作為一種備受矚目的基因組定向編輯技術，在人類細胞、小鼠和斑馬魚等物種中成功實現(xiàn)了基因組的定點修飾，并且具有較高的突變率[10-13]。本研究利用CRISPR/ Cas9技術編輯斑馬魚ifi30基因，定點敲除特定位點的序列，以獲得穩(wěn)定遺傳的ifi30基因缺失的純合個體，為研究該基因在免疫中的功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用AB品系斑馬魚，來自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所自動循環(huán)水系統(tǒng)中。光暗周期比率為14h∶10h（14 Light∶10 Dark）。按雌雄3∶2的比例將性成熟、健康的斑馬魚放入產卵盒內，用擋板將雌雄魚分開。次日注射前將擋板取出，使其完成產卵與受精。

1.2 基因靶位點設計

本試驗采用特定的限制性內切酶檢測突變，利用ChopChop設計ifi30的靶位點、PCR檢測引物和內切酶。ifi30基因具有7個外顯子，在第一個外顯子上選擇GGACATAGCAGCTGAATGT為靶位點。采用PCR擴增質粒的方法獲得gRNA序列，在靶位點前增加上T7啟動子序列，后增加上gRNA序列，獲得的gRNA引物和檢測PCR引物見表1。Chop-Chop設計的ifi30檢測內切酶為Pvu II（NEB公司），該酶在相應PCR擴增片段中有一個酶切位點。酶切后，ifi30野生型（+/+）有2條帶，分別為294bp和147bp；純合突變型（-/-）僅1條帶，為441bp；雜合型（+/+）有3條帶，包括了野生型條帶和突變型條帶，分別是294bp、47bp和441bp。

1.3 PCR擴增獲得gRNA

用引物ifi30和PT7reverse組合擴增，加入2ng的pT7-gRNA質粒（Addgeng網站購買）為模板。擴增程序為：95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；35個循環(huán)，72℃，5min。用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，產物約120bp。檢測后用PCR產物純化試劑盒（Axygen）純化回收PCR產物，測定濃度，作為gRNA待用。

1.4 gRNA和Cas9體外轉錄

gRNA用MEGAshortscriptTMT7 High Yield Transcription Kit體外轉錄；Cas9表達質粒pCS2-nCas9n（Addgeng網站購買）用內切酶Not I（NEB公司）線性化，回收后用mMESSAGE mMACHINE SP6體外轉錄，轉錄結束后，用DNase去除DNA殘留，試劑盒回收RNA，檢測RNA的濃度和純度，-80℃冰箱保存待用。

1.5 顯微注射及檢測

體外轉錄的sgRNA和Cas9 mRNA混合后加入25%的酚紅后，顯微注射到單細胞期的斑馬魚胚胎中。sgRNA和 Cas9 mRNA的注射量分別為200pg/μL和300pg/μL，對照組為等量的25%的酚紅。注射后24～48h之間檢測突變率。在發(fā)育良好的胚胎中加入40mL裂解液[10mMTris（1mol/L）、pH8.0，50mM KCl（3mol/L）、0.3%的 Tween20和 NP40、0.5mg/mL的蛋白酶K]，55℃裂解2h，98℃10min。取出后震蕩混勻，離心，取上清液為模板。用PCR檢測引物擴增，20μL PCR擴增體系，程序同gRNA的PCR擴增。酶切鑒定PCR產物。將獲得的突變進行TA克隆，檢測變異克隆，測序，獲得突變序列。

1.6 變異檢測

注射的斑馬魚與野生型斑馬魚交配獲得F1代，篩選出F1突變個體，突變個體自交獲得F2。F2代中理論上包含純合突變個體、雜合個體和野生型。F2代突變純合個體群交，獲得穩(wěn)定遺傳的突變系（圖1）。

2 結果與分析

2.1 gRNA靶位點的選擇及載體的構建

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

圖1 交配策略Fig.1 Mateing tactics in various types of zebrafish

通過ChopChop系統(tǒng)搜索和確定gRNA的靶位點。輸入ifi30基因外顯子序列獲得一系列關于sgRNA識別靶位點，選擇ifi30基因第一個外顯子上的GGACATAGCAGCTGAATGT為靶位點。合成ifi30和PT7 reverse引物（引物序列見表1），以pT7-gRNA質粒為模板進行PCR擴增，獲得l 120bp左右的產物片段（圖2）。

圖2 gRNA的電泳圖譜（M：DL2000）Fig.2 Electrophoresis patterns of gRNA（Marker：DL2000）

2.2 突變效率計算

顯微注射24h后，選擇發(fā)育良好的胚胎進行裂解提取DNA，每組檢測50枚胚胎，共計5組，分別用引物ifi30F和ifi30R進行PCR擴增，酶切檢測突變率。結果表明：1～5組的突變效率分別為89%、83%、95%、90%和79%，平均突變率為87.2%。

2.3 F1代突變個體獲得

將注射的斑馬魚F0代飼養(yǎng)至性成熟，與野生型（AB系）斑馬魚進行1∶1配組，產生F1子代，共配10組。受精24h后，提取受精卵DNA進行PCR后酶切，檢測突變情況。10組F1代斑馬魚中，有3組檢測到突變，突變率為30%。圖3為其中一組突變檢測結果，圖中1號和3號樣本為三條帶，屬于雜合型突變，說明DNA序列發(fā)生了變異，改變了酶的識別位點。將突變個體DNA進行PCR擴增，回收產物進行TA克隆測序。圖4為突變個體1的測序結果，與參照序列對比，在箭頭位置缺失了5個堿基CTGAA。圖5顯示了3個突變體的突變位點缺失情況。由圖5可知，F(xiàn)1代ifi30基因序列產生了不同程度的缺失。突變個體1刪除了5個堿基CTGAA，突變個體2刪除了4個堿基TGAA，突變個體3刪除了6個堿基TGAATG。

圖3 F1代突變電泳圖Fig.3 Electrophoresis patterns of F1mutations

圖4 突變1的測序圖（箭頭代表缺失位點的位置）Fig.4 The sequence diagram of mutation 1（the arrow showing the missing position）

圖5 F1代ifi30基因位點的突變Fig.5 Mutations of F1at ifi30 gene target sites

突變1和突變2變異的堿基數不是3的整倍數，理論上能夠在蛋白翻譯過程中造成移碼，生成新的蛋白。將突變1和突變2飼養(yǎng)至性成熟，分別自交，獲得2組自交F2代個體，F(xiàn)2代個體中理論上包含純合突變個體（-/-），雜合個體（+/-）和野生型（+/+）。取受精后2h和24h的成活卵檢測2組F2代受精卵的突變，每次每組檢測50個樣本。檢測發(fā)現(xiàn)，受精2h的樣本包含10個純合突變個體（-/-）、28個雜合突變個體（+/-）和12個野生型個體（+/+），基本符合孟德爾遺傳定律；受精24h的樣本包括0個純合突變個體（-/-）、33個雜合突變個體（+/-）和17個野生型個體（+/+）（圖6和圖7）。受精2h檢測，樣本4、7、8和12僅含1條帶，與對照帶基本一致，為純合突變個體（-/-），而在受精24h沒有純合突變個體（-/-），說明實驗成功地沉默了ifi30基因；ifi30是胚胎發(fā)育中的一個關鍵基因，ifi30基因突變，使胚胎死亡。

圖6 受精2h樣本突變的檢測結果Fig.6 The mutations in 2 h post-fertilization

圖7 受精24h樣本突變的檢測結果Fig.7 The mutations in 24 h post-fertilization

3 討論

基因組靶向編輯技術能使生物基因組DNA中的特定位點發(fā)生改變[13-15]，是研究基因功能的重要工具，用人工核酸酶可以提高基因編輯效率。目前常見的基因敲除系統(tǒng)有3種：ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9。ZFNs和TALENs對每個新的DNA靶點必須要經過一個再加工過程，費時費力[16,17]。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，可以在不同位點同時引入多個突變，僅需對gRNA進行編輯，是目前應用最廣泛的基因編輯技術，已成功應用于微生物、動植物等諸多物種的基因組改造[8,9]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因突變具有較高的突變率，本試驗檢測了5組注射后的樣本，最高突變率的為95%，最低為79%，平均為87.2%，表現(xiàn)出較高的突變效率。性成熟F0代與野生型AB配組的突變率為30%。注射后，檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代樣本突變率高于F0與野生型配組產生的F1代的突變率，這是由于注射后，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用下，基因組發(fā)生了編輯。注射一般在1細胞期，但已經有部分細胞已經發(fā)育，每個胚胎的注入位置也不同，在細胞內能發(fā)生基因編輯的位置也不確定，因此只能得到F0代嵌合體。注射24h采用的是整個胚胎，包含了所有組織的變異，具有較高的突變率。而為了獲得純合系，要選擇生殖細胞發(fā)生突變，且能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。本研究發(fā)現(xiàn)，突變個體也是僅有部分卵細胞發(fā)生突變，因此F0代與野生型AB配對的突變率要遠低于注射后檢測的突變率。

本研究用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯ifi30基因。ifi30基因編碼干擾素γ誘導蛋白30，位于斑馬魚2號染色體上，具有7個外顯子，全長1 057bp。靶位點起始于mRNA的第211個堿基，位于第一外顯子區(qū)域。突變1刪除的5bp，序列在222～226bp，突變2刪除的4bp，序列是223～226bp，均不是3的整數倍。移碼突變的結果將引起該段肽鏈的改變，而肽鏈的改變將引起蛋白質性質的改變，最終引起性狀的變異，嚴重時會導致個體的死亡。突變1和突變2均能夠引起移碼突變，且位于第一外顯子能更大程度地影響基因的轉錄和翻譯，達到沉默基因的效果。對ifi30基因突變的雜合子觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的異常，但ifi30基因突變的純合子在胚胎發(fā)育過程中死亡。這是由于雜合子還存在完整的ifi30基因，能夠正常翻譯具有功能的干擾素γ誘導蛋白30，因此未見異常。在突變純合子中，ifi30基因不能被翻譯成具有功能的干擾素γ誘導蛋白30，因此胚胎死亡，可見ifi30蛋白是胚胎發(fā)育過程中必不可少的一種蛋白，能夠參與抗原呈遞和加工，影響對機體病毒免疫、腫瘤免疫、寄生蟲的抗原免疫應答[4-6]。推測ifi30基因突變的純合體，造成免疫缺陷，因而在胚胎期發(fā)生死亡。為了進一步了解ifi30基因在免疫過程中發(fā)揮的作用，今后應通過條件性敲除，研究不同發(fā)育階段和不同組織中ifi30基因的功能。

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Knock Out of Interferon-gamma-inducible Gene 30 in Zebrafish by CRISPR/Cas9

CAO Ding-chen,TONG Guang-xiang，LV Wei-hua,SUN Zhi-peng,KUANG You-yi，ZHENG Xian-hu，SUN Xiao-wen
（Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The interferon-gamma-inducible protein 30（ifi30）gene,as central regulators of immunity in vertebrates,was knocked out in zebrafish using CRISPR/Cas9 to investigate regulation of the immunity by interferons.The small guide RNAs were designed using CHOPCHOP software to target the first exon of ifi30 gene,and synthesized with PCR.After transcribed in vitro,the mixed mRNAs of guide RNAs and Cas9 were micro-injected into fertilized eggs.The restricted enzyme Pvu II was used for screening genetic mutation in 24hpf embryos,and the mutation rate was found to be ranged from 79%to 95%,with mean value of 87.2%.In order to obtain stable genetic homozygous mutant lines,the F0individuals were crossed with wild type zebrafish,and 3 mutant alleles were identified in F1,in which two alleles（named Mut1 and Mut2）caused frameshifts in ifi30 gene,while the other allele did not cause the stop-gained mutant with 6 bp deletion.The heterozygous individuals with Mut1 and Mut2 alleles were normal in growth and development,while the homozygous embryos with Mut1 and Mut2 allele in F2generation did not develop into larva,the homozygous mutant genotypes only found in survival embryos after 24hpf.The findings suggested that the functional deficiency of ifi30 may result from frame-shift caused death of the embryos during development.

zebrafish;ifi30;CRISPR/Cas9;knock-out

S917

A

1005-3832（2016）06-0026-05

2016-10-11

中國水產科學研究院基本科研業(yè)務費（2016HY-ZD0301）；農業(yè)部948項目（2016-X15）.

曹頂臣（1973-），男，副研究員，從事魚類分子育種研究.E-mail:caodingchen@hrfri.ac.cn

孫效文，研究員.E-mail:sunxw2002@163.com