轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2在冠心病猝死早期心肌缺血中的表達(dá)及意義

章麗霞，王宇，張麗華，牛彩琴

(1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.平?jīng)鍪袐D幼保健醫(yī)院，甘肅 平?jīng)?744300)

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轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2在冠心病猝死早期心肌缺血中的表達(dá)及意義

章麗霞1，王宇2，張麗華1，牛彩琴1

(1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.平?jīng)鍪袐D幼保健醫(yī)院，甘肅 平?jīng)?744300)

目的：了解冠心病猝死(sudden coronary death，SCD)者心肌中TGF-β1和ERK1/2中的表達(dá)情況，探討其對(duì)SCD 診斷的意義。方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在30 例SCD心肌樣本(SCD組)和15 例非心源性即刻死亡心肌樣本(對(duì)照組)的表達(dá)情況。結(jié)果：SCD組心肌TGF-β1和ERK1/2 的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，t值TGF-β1為19.807，ERK1/2 為15.478，兩種指標(biāo)組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TGF-β1和ERK1/2在SCD組中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.642,P<0.01)。結(jié)論：心肌缺血激活TGF-β1/ERK1/2信號(hào)通路，使其在心肌中表達(dá)明顯升高，檢測(cè)TGF-β1和ERK1/2可為SCD 的早期心肌缺血病理診斷提供客觀指標(biāo)。

冠心病猝死；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；免疫組織化學(xué)

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員之一,是Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的重要成分,ERK1/2被激活后，形成磷酸化的ERK(P-ERK)，介導(dǎo)信號(hào)傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等多種生理過(guò)程[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是MAPK信號(hào)通路的上游信號(hào)，TGF-β1參與心肌的修復(fù)和重塑[2]。研究表明，在心肌缺血/再灌注過(guò)程中激活ERK1/2的信號(hào)通路。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)TGF-β1和ERK1/2在冠心病猝死(sudden coronary death，SCD)心肌和非心源性原因即刻死亡者心肌中的表達(dá)情況，旨在探討TGF-β1/ERK1/2對(duì)冠心病猝死早期病理形態(tài)診斷的提供客觀指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 樣本及分組

SCD組來(lái)自川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2010年1月至2015年12月SCD早期心肌缺血標(biāo)本30例，男性 25 例，女性 5 例，年齡42～71歲，平均年齡(46.8±1.53)歲。早期心肌缺血診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中華外科病理學(xué)》[3]及相關(guān)文獻(xiàn)[4]，即死者生前發(fā)病至死亡在24 h內(nèi)，排除暴力死和其它疾病致死可能，冠狀動(dòng)脈主干或至少有1只冠狀動(dòng)脈分支狹窄程度≥Ⅲ級(jí)，尸檢及常規(guī)病理學(xué)檢查證實(shí)為早期心肌缺血(未發(fā)展到典型的心肌梗塞)。對(duì)照組15例，男性13例，女性2例，年齡17～68歲，平均年齡(34.2±2.04)歲，死者為交通事故或高墜導(dǎo)致嚴(yán)重顱腦損傷，經(jīng)系統(tǒng)尸檢排除其他死因并證實(shí)死者生前均由非心源性原因引起即刻死亡，冠狀動(dòng)脈硬化病變程度在Ⅱ級(jí)以下。

1.2 試劑與方法

SCD組和對(duì)照組心肌樣本均用10%甲醛固定，SCD組取心肌典型病變部位，對(duì)照組取與SCD組相對(duì)應(yīng)的心肌。樣本大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，所有心肌樣本連續(xù)切片3 張，切片厚度3 μm，貼于組織防脫載玻片上，置于60 ℃烤箱中烘干后，取切片脫蠟至水，進(jìn)行常規(guī)HE 染色以及免疫組織化學(xué)染色。

TGF-β1和ERK1/2免疫組織化學(xué)染色：兔抗人TGF-β1多克隆抗體(abcam，ab92486)，兔抗人ERK1/2多克隆抗體(abcam，ab32538)；均用0.01mmol /L pH 6. 0 枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原高壓修復(fù)，已知宮頸癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。即用型快速免疫組織化學(xué)Maxvision檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，進(jìn)行免疫組織化學(xué)( 二步法) 染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

1.3 結(jié)果判斷

TGF-β1和ERK1/2均以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)散在棕黃色或棕黑色顆粒為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)觀察10 個(gè)10×20視野并拍照，按切片中顯色細(xì)胞的比例判定，染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%且染色強(qiáng)度為棕黃色，即記為陽(yáng)性，否則為陰性。采用Image pro plus 6.0 圖像分析軟件對(duì)目的蛋白表達(dá)含量進(jìn)行分析，分別測(cè)定TGF-β1和ERK1/2的光密度值A(chǔ)，以10個(gè)視野的A 值的平均值作為各標(biāo)本的TGF-β1和ERK1/2的表達(dá)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肉眼檢查和HE染色結(jié)果

SCD組：冠狀動(dòng)脈在主干或至少1個(gè)分支存在管腔狹窄，管腔狹窄Ⅲ級(jí)有 22 例，Ⅳ級(jí)8例；其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生在左主干有4例(Ⅳ級(jí)管腔狹窄)，左前降支(LAD)有15例(Ⅲ、Ⅳ級(jí)管腔狹窄分別為13、2例)，左旋支4例(Ⅲ級(jí)管腔狹窄) ，右主干有5例(Ⅲ、Ⅳ級(jí)管腔狹窄分別為3、2例)，左前降支與左旋支均有Ⅲ級(jí)管腔狹窄1例，左前降支與右主干均有Ⅲ級(jí)管腔狹窄1例，無(wú)血栓形成和/或斑塊破裂，心肌未見(jiàn)異常。HE染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞濁腫，橫紋消失，部分心肌波浪樣變，心肌灶性或片狀嗜伊紅染色增強(qiáng)，心肌纖維斷裂，收縮帶形成(圖1A)。

對(duì)照組：未見(jiàn)冠狀動(dòng)脈主干狹窄，2例左旋支、1例左旋降支粥樣硬化，其管腔狹窄程度均在Ⅱ級(jí)度以下外，未發(fā)現(xiàn)心臟有異常情況。HE染色未見(jiàn)異常(圖1B)。

2.2 TGF-β1和ERK1/2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

TGF-β1和ERK1/2均主要表達(dá)在胞漿，呈棕黃或棕褐色顆粒且較為彌散，偶見(jiàn)在胞漿和細(xì)胞核表達(dá)；小血管及間質(zhì)炎細(xì)胞多為均質(zhì)狀棕褐色，心肌間質(zhì)不表達(dá)。 TGF-β1在 SCD組心肌表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖2A)，在對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2B)，其光密度值分別為(94.822±5.333)和(30.421±14.841)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.807，P<0.01)。ERK1/2在SCD組和對(duì)照組心肌的免疫組化結(jié)果與TGF-β1類(lèi)似，ERK1/2在SCD組表達(dá)(95.618±10 720)高于對(duì)組的表達(dá)(30.611±15.869)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.478，P<0.01)。

本試驗(yàn)亦對(duì)TGF-β1和ERK1/2在SCD組中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，TGF-β1和ERK1/2在SCD組中表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.64，P<0.01)。

3 討論

TGF-β1是一個(gè)強(qiáng)有力的促纖維化細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌和旁分泌作用于成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞表型改變，顯著提高膠原合成能力[5-6]，促進(jìn)膠原蛋白和纖維連接蛋白合成；下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶并上調(diào)其組織抑制劑，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積參與心肌細(xì)胞促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展[7-8]。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示：TGF-β1在SCD組的光密度值高于對(duì)照組心肌，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明急性缺血性心肌損傷可導(dǎo)致心肌中TGF-β1表達(dá)增加，提示缺血性損傷激活TGF-β1，活化的TGF-β1與靶細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化與組織修復(fù)，參與炎癥和免疫等生物效應(yīng)[9]。因此，TGF-β1 是缺血后從炎癥階段向瘢痕形成過(guò)渡的關(guān)鍵因子[10]。

ERK1/2在正常心肌細(xì)胞中低表達(dá)。心肌缺血再灌注損傷后，氧化應(yīng)激激活ERK1/2通路[11]，而ERK1/2在缺血再灌注損傷的恢復(fù)中起著重要作用[12]。本次試驗(yàn)檢測(cè)到ERK1/2在SCD組的光密度值明顯高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明ERK1/2參與急性心肌缺血的損傷過(guò)程，其機(jī)制可能是缺血損傷激活ERK1/2，被激活的ERK1/2可抑制心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]。因此，ERK1/2通過(guò)參與缺血損傷后適應(yīng)的心臟保護(hù)作用而降低梗死面積[14-15]。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與心肌缺氧預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[16-17]。

本試驗(yàn)通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和ERK1/2在SCD組心肌中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.64，P<0.01)，其機(jī)制可能是TGF-β1作為MAPK信號(hào)通路的上游信號(hào)的激活劑，激活MAPK信號(hào)通路[10,18]，使ERK1/2激活，ERK1/2激活后抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活進(jìn)而保護(hù)損傷的心肌[19-20]。提示TGF-β1/ERK1/2 信號(hào)通路參與并介導(dǎo)心肌缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用。

綜上所述，心肌缺血損傷后可激活TGF-β1/ERK1/2信號(hào)通路，使TGF-β1和ERK1/2表達(dá)增高，提示TGF-β1和ERK1/2可作為判斷SCD猝死早期形態(tài)診斷的有用指標(biāo)，具有法醫(yī)學(xué)意義。

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(學(xué)術(shù)編輯：劉云)

Expression and significance of TGF-β1 and ERK1/2 in the sudden death of coronary heart disease early myocardial ischemia

ZHANG Li-xia1，WANG Yu2，ZHANG Li-hua1，NIU Caiqin1

(1.NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan；2.PingliangMaternalandChildHealthCareHospital,Pingliang744300,Gansu,China)

Objective：To observe the expressions of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in the myocardium of patients of sudden coronary death and to explore the significance of SCD diagnosis.Methods：The heart samples of thirty cases of sudden coronary death were chosen as experiment group while the heart samples of fifteen cases of non sudden coronary death were chosen as control group. Immunohistochemical staining was employed to examine the expressions of TGF-β1 and ERK1/2 in the myocardium． Results：The expressions of TGF-β1 and ERK1/2 in experiment group was significantly higher than those in control group，the t value of TGF-β1 was 19.807,ERK1/2 was 15.478,two indicators between two groups were compared,the differences were statistically significant (P<0. 01) .The expressions of TGF-β1 positively related to ERK1/2 in SCD(r=0.64，P<0.01).Conclusion：TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway could participate in the process of apoptosis,the detection of the positive expressions of two indicators in the myocardium may provide an objective index for the early pathological diagnosis of SCD.

Sudden coronary death；Transforming growth factor-β1；Extracellular signal-regulated kinase 1/2；Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.009

四川省教育廳課題(12ZB225，14ZA0182)

2016-04-08

章麗霞(1977-)，女，碩士，副教授。

牛彩琴，E-mail：niucaiqin@126.com

時(shí)間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.018.html

1005-3697(2016)06-0813-03

R541.4

A