基于MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點/米托蒽醌復合體系對DNA的檢測

司芳瑞， 苗艷明， 楊茂青， 閆桂琴

(山西師范大學 生命科學院， 山西 臨汾 041000)

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基于MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點/米托蒽醌復合體系對DNA的檢測

司芳瑞， 苗艷明*， 楊茂青， 閆桂琴*

(山西師范大學 生命科學院， 山西 臨汾 041000)

利用3-羥基丙酸(MPA)包覆的Mn摻雜ZnS量子點與鹽酸米托蒽醌(MTX)構建了一種可簡單測定DNA的磷光復合體系。該體系以MTX作為良好的電子受體，通過光誘導電子轉移(PIET)原理猝滅Mn摻雜ZnS量子點的室溫磷光(RTP)。當體系中加入DNA后，DNA通過靜電和嵌插作用與MTX結合，形成更穩定的復合物，并使MTX從Mn摻雜ZnS量子點表面脫離，Mn摻雜ZnS量子點的RTP恢復，從而實現了對DNA的痕量檢測。該體系檢測DNA的線性范圍為0.1～20 mg·L-1，檢出限為0.07 mg·L-1。該方法可有效避免其他共存物質的干擾并可應用于實際生物樣品中DNA含量的快捷測定。

量子點; 室溫磷光; 檢測; DNA; 鹽酸米托蒽醌

1 引 言

量子點又稱為半導體納米晶體，因其優良的光學性能和電學性質而被廣泛應用于生物、食品、醫學等研究領域[1-5]。相較于傳統的有機染料，量子點具有激發和發射光譜窄而對稱、光穩定性好、發光效率高等優點[6-7]，更適合于各種生物分子的光學檢測。在以往的研究中，大量的分析主要集中于量子點的熒光性質，而對量子點的磷光性質關注較少。近年來，量子點的室溫磷光 (RTP) 性質在分析化學領域引起許多學者的關注[8-18]。磷光源于三線態，壽命較熒光更長，從而可以更有效地避免生物體液中背景熒光和散射光的干擾[19]。磷光較熒光更為少見，因此可增強檢測過程的選擇性[20-21]。此外，采用室溫磷光分析檢測無需除氧劑和誘導劑的使用，可有效地簡化分析程序。磷光量子點更優越的性能賦予了其在復雜化學和生物基質檢測中更多的優勢及應用前景。

脫氧核糖核酸(DNA)是生命體的基本遺傳物質，也是生物遺傳信息的主要載體，在生物的許多生命活動中均發揮著重要作用[22]。鑒于DNA重要的作用和功能，DNA的定量分析與特異性識別已成為基因組學、病毒學、分子生物學等領域研究的焦點之一[23]。目前關于DNA檢測的方法雖已廣見報道[24-26]，然而實現DNA靈敏檢測依然是眾多研究者致力的方向。篩選和構建DNA有效識別體是實現DNA簡單、靈敏檢測的有效手段。

鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone，MTX)作為一種典型蒽環類抗癌藥物，對人類的多種惡性腫瘤疾病有較好的臨床效果[27]。MTX可有效嵌入DNA分子結構中并與堿基對結合形成交叉鍵聯[28-29]，從而抑制癌細胞DNA的構建并導致癌細胞死亡，因此MTX本身可作為DNA的一種特異性識別體。

本研究基于Mn摻雜ZnS量子點優越的室溫磷光性能及MTX對DNA的特異識別功能構建了一種簡單檢測DNA的RTP探針，能夠有效避免來自生物體液中背景熒光和散射光的干擾，無需化學修飾和固定化過程，并可用于實際樣品的分析。

2 實 驗

圖1所示為Mn摻雜ZnS量子點/鹽酸米托蒽醌納米復合物對DNA的檢測原理圖。MTX作為猝滅劑通過PIET過程猝滅Mn摻雜ZnS量子點的RTP。當體系中加入DNA后，DNA能通過嵌插和靜電作用競爭結合MTX，并使MTX從Mn摻雜ZnS量子點表面脫離，Mn摻雜ZnS量子點的RTP恢復。

圖1 (a) Mn摻雜ZnS量子點/鹽酸米托蒽醌納米復合物對DNA的檢測原理圖；(b) MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點的結構；(c) 鹽酸米托蒽醌的結構。

Fig.1 (a) Schematic illustration of Mn-doped ZnS QDs/MTX nanohybrids for DNA detection. (b) Structure of MPA-capped ZnS∶Mn QDs. (c) Structure of MTX.

2.1 材料與儀器

3-羥基丙酸(3-mercaptopropionic acid，MPA)、乙酸鋅(Zn(Ac)2·2H2O)、乙酸錳(Mn(Ac)2·2H2O)和硫化鈉(Na2S·9H2O)分別購于百靈威科技有限公司、天津市科密歐化學試劑有限公司；鮭魚精子DNA(hsDNA)購于Sigma公司(美國)；鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hcl，MTX)購于中國醫藥集團；其他所用試劑均為分析純。實驗所用高純水(18.2 MΩ/cm)采用WaterPro純化水系統(Labconco公司，美國)制備。

2.2 儀器

量子點的外觀形貌通過JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子，日本)表征，Mn摻雜ZnS量子點/MTX納米復合物的形態通過JSM-7500F掃描電子顯微鏡(日本電子，日本)表征。pH值由pH計(上海雷磁，中國)測定。磷光光譜采用Cary Eclipse 熒光分光光度計(瓦連有限公司，美國)進行測定。共振光散射(Resonance light scattering，RLS)信號在Cary Eclipse熒光分光光度計(瓦連有限公司，美國)上測定,(Δλ=0)，掃描波長為200～700 nm。紫外吸收光譜通過UV-29100 UV/Vis(日本島津，日本)紫外分光光度計進行測定。

2.3 Mn摻雜ZnS量子點的合成

MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點參照文獻[30-31]制備：室溫下于100 mL三口燒瓶中，依次加入0.04 mol·L-1的MPA的水溶液50 mL、0.1 mol·L-1的Zn(Ac)2水溶液5 mL、0.01 mol·L-1的Mn(Ac)2水溶液2 mL。用1 mol/L的NaOH溶液調節上述混合溶液的pH值至11.0。在氬氣氛圍中磁力攪拌反應30 min后，向溶液中加入0.1 mol·L-1的硫化鈉溶液5 mL，繼續于氬氣保護下攪拌反應20 min，再于空氣氛圍中50 ℃陳化2 h。冷卻后，加入等體積無水乙醇，醇析、離心，沉淀于室溫下真空干燥24 h，即得預制備的量子點。

2.4 室溫磷光檢測

首先配制0.1 mmol·L-1的MTX水溶液和2 mg·mL-1的MPA包裹的Mn摻雜ZnS量子點水溶液。在一系列10 mL的比色管中，依次加入250 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4，20 mmol·L-1)、50 μL的量子點溶液和不同體積的MTX溶液，用高純水定容至5 mL，搖勻，靜置5 min后進行磷光光譜分析。激發波長為295 nm，掃描范圍為500～700 nm。

檢測DNA時，首先將DNA與PBS溶液(20 mmol·L-1，pH=7.4)混合溶解并制備100 mg·L-1的DNA母液。然后，將50 μL的MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點、4.0 μmol·L-1的MTX溶液以及不同濃度的DNA溶液加入到系列比色管中，搖勻，靜置5 min后進行磷光光譜分析，檢測條件同上。

2.5 實際樣品的制備

血清和尿液樣品均源于健康志愿者，使用前稀釋100倍，無需其他復雜的預處理。

3 結果與討論

3.1 MPA包裹的ZnS∶Mn量子點的表征

圖2(a)為MPA包裹的ZnS∶Mn量子點樣品的透射電鏡照片，從中可以看出，所合成的量子點尺寸較為均一，粒徑約為3.5 nm。圖2(b)為MPA包裹的ZnS∶Mn量子點樣品的X射線衍射圖譜，譜中呈現3個明顯的衍射峰，分別對應于立方型閃鋅礦結構的(110)、(220)和(311)晶面，說明所合成的ZnS∶Mn量子點具有典型立方型結構。圖2(c)為MPA包裹的ZnS∶Mn量子點樣品的激發和發射光譜。 合成的量子點的最強激發峰位于295 nm處，而最強發射峰位于590 nm處。590 nm處的發射峰為Mn2+∶4Tl-6Al的躍遷產生[30]。

圖2 MPA包裹的ZnS∶Mn量子點樣品的透射電鏡照片(a)、X-射線衍射圖譜(b)以及激發和發射光譜(c)。

Fig.2 TEM image (a), XRD patterns (b), and excitation and emission spectra (c) of MPA-capped ZnS∶Mn QDs, respectively.

3.2 ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合體系的形成

為考察利用MPA包覆的ZnS∶Mn量子點與MTX構建復合體系的可行性，我們首先分析了MTX對 ZnS∶Mn量子點室溫磷光強度的影響。 如圖3所示，MPA包覆的ZnS∶Mn量子點溶液中加入MTX后，體系RTP發生明顯猝滅，且RTP猝滅強度與MTX呈現明顯的劑量效應關系(圖3內嵌圖)。在MTX濃度達到6 μmol·L-1后，ZnS∶Mn量子點的RTP強度不再明顯變化。

圖3 MTX對MPA包覆的ZnS∶Mn量子點室溫磷光發射光譜的影響，內嵌圖為MPA包覆的ZnS∶Mn量子點的RTP強度隨濃度的變化曲線。 MPA包覆的ZnS∶Mn量子點的濃度為20 mg·L-1，MTX濃度(a～i)依次為0,0.2,0.4,0.8,2,4,6,8,10 μmol·L-1。

Fig.3 RTP emission spectra of MPA-capped ZnS∶Mn QDs in the presence of different concentrations of MTX. The inset shows the change of RTP intensity with the increase of the concentration of MTX. The concentration of MPA-capped ZnS∶Mn QDs is 20 mg·L-1. The concentration of MTX (from a to i) is 0, 0.2, 0.4, 0.8, 2, 4, 6, 8, 10 μmol·L-1.

ZnS∶Mn量子點經MPA包覆后在水溶液中呈明顯的負電性，而MTX在弱堿性溶液中帶正電，因此，二者易通過靜電作用而相互結合，形成ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合物。 MTX是一種良好的電子受體，能通過PIET過程猝滅ZnS∶Mn量子點的RTP。

3.3 ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系的穩定性

基于以上結果，我們進一步對影響體系穩定性的因素進行了優化。通過溶液pH值對體系穩定性的影響發現(圖4(a))：溶液pH值在4.5～9.5范圍內變化時，ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系的RTP強度隨著溶液pH值的增大而增大。溶液pH值在6.0～7.5之間時，體系RTP強度相對保持穩定。考慮到體系用于生物體液分析的便捷性，我們選擇pH=7.4為最佳的pH條件。通過反應時間對體系穩定性的影響發現(圖4(b))：量子點溶液中加入MTX后，在后續的40 min基本無明顯變化。就鹽濃度對體系的穩定性影響而言(圖4(c))，NaCl濃度在0～0.05 mol·L-1范圍內時，體系RTP的強度基本保持穩定。

圖4 pH值(a)、時間(b)和離子濃度(c)對ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合材料RTP強度的影響。

Fig.4 Effect of pH value(a), reaction time(b), and NaCl concentration(c) on the RTP intensity of MPA-capped ZnS∶Mn QDs/MTX composite system, respectively.

3.4 基于ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系的DNA檢測探針

圖5(a)為向MPA包覆的ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系中加入不同濃度的DNA后的發射光譜。 體系的RTP強度隨DNA濃度的增加而逐漸恢復，表明Mn摻雜ZnS量子點/MTX復合體系可以作為測定DNA的RTP探針。但在單純的MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點溶液中加入不同濃度( 0～20 mg·L-1)的DNA， ZnS∶Mn量子點的RTP強度基本保持不變(圖5(b))，說明MPA包覆的ZnS∶Mn量子點不與DNA發生作用。MTX作為一種抗癌藥物可與DNA發生有效的相互作用。通過共振光散射(RLS)分析證實，單純的DNA與MTX的RLS均較弱，但二者混合后(圖5(c))，保持MTX濃度不變，體系的RLS強度隨著DNA濃度的增加而增大，表明二者的相互作用可形成更大的散射粒子。圖5(d)為樣品的紫外-可見吸收光譜。當ZnS∶Mn量子點中加入MTX后，其紫外吸收增強并出現紅移現象。當ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合材料中加入DNA后，其紫外吸收進一步增強并紅移。DNA加入后，能在ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合材料表面競爭結合MTX，使得MTX從量子點表面脫附后與DNA結合，通過嵌入作用形成了DNA和MTX的新復合物，從而致使紫外吸收光譜有較大變化。由以上結果可知，MTX與Mn摻雜ZnS量子點之間、DNA與Mn摻雜ZnS量子點/MTX納米復合材料之間都存在著相互作用。

圖5 (a) MPA包覆的ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系中加入不同濃度的DNA后的發射光譜；(b) 純MPA包覆的ZnS∶Mn量子點溶液中加入不同濃度的DNA后的RTP強度；(c) MPA包覆的ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系中加入不同濃度的DNA后的共振光散射光譜；(d) 樣品的紫外-可見吸收光譜。

Fig.5 (a) DNA concentration-dependent RTP emission of MPA-capped ZnS∶Mn QDs/MTX hybrids. The concentration of DNA(from a to h) is 0.4, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 mg·L-1. (b) RTP intensity of pure MPA-capped ZnS∶Mn QDsvs. the concentration of DNA. (c) DNA concentration dependent RLS of MTX. The concentration of DNA is 0(a), 1(b), 2(c) mg·L-1. (d) UV-Vis absorption spectra of MTX(a), MPA-capped ZnS∶Mn QDs (b), MPA-capped ZnS∶Mn QDs/MTX nanohybrids(c), and MPA-capped ZnS∶Mn QDs/MTX + DNA(d), respectively.

3.5 MTX與DNA的作用機理

圖6(a)為MTX和DNA結合后的吸收光譜，由圖可知，隨著DNA濃度的加大，MTX在245 nm處的紫外吸收峰逐漸降低，同時有紅移現象產生[32]。由于醌類藥物吸收光譜紅移現象的產生是醌類藥物結合插入到DNA的重要依據，因此以上結果表明MTX的醌環平面插入到了DNA結構的堿基對之間，進而結合在一起。

圖6 (a) MTX 與 DNA相互作用的紫外-可見吸收光譜；(b) MTX 與 DNA相互作用的熒光光譜。

Fig.6 (a) Absorption spectra of MTX in the presence of various concentrations of DNA. The concentration of DNA (from a to d): 0, 1, 10, 20 mg·L-1. (b)Fluorescence spectra of MTX in the presence of various concentrations of DNA. The concentration of DNA (from a to h): 0, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 20 mg·L-1.

MTX自身帶有較強的熒光，如圖6(b)所示，隨著DNA濃度的加大，MTX的熒光強度呈下降趨勢，這種現象可能是由于MTX的醌環平面插入到DNA結構的堿基對之間形成氫鍵所致[33]。

研究MTX和DNA作用機制的重要依據是二者相互作用后引起DNA結構的變化。以上結果表明：MTX與DNA之間作用既存在靜電作用，又存在作用很強的插入作用，但ZnS∶Mn量子點是依靠靜電作用和MTX吸附在一起，因此，ZnS∶Mn量子點和MTX之間的作用力小于MTX和DNA之間的作用力，致使DNA能使MTX從Mn摻雜ZnS量子點/MTX納米復合材料表面脫附，并使 Mn摻雜ZnS量子點的RTP恢復。

3.6 Mn摻雜ZnS量子點/MTX復合體系對DNA的檢測

在最佳實驗條件下，我們進一步建立了DNA濃度與Mn摻雜ZnS量子點/MTX復合體系RTP強度之間的線性響應關系，如圖7所示。當DNA濃度在0.1～20 mg·L-1范圍內時，DNA濃度與復合體系MPA包覆的ZnS∶Mn量子點的RTP強度的改變(ΔIRTP)之間呈良好的線性響應關系，線性方程為ΔIRTP=8.3019C(DNA)-0.6492 (R= 0.993)，該方法的檢出限(3σ)為0.07 mg·L-1，不含DNA和含0.5 mg·L-1DNA體系的RTP強度差值連續11次平行測定的相對標準偏差為3.8%。

該方法可以避免檢測時自體熒光和散射光的干擾，同時不需要加入任何除氧劑和誘導劑，避免了復雜的樣品預處理過程，所以ZnS∶Mn量子點/MTX納米復合物對DNA的檢測體系具有更強的優越性。

圖7 ZnS∶Mn量子點/MTX復合體系測定DNA的標準曲線

Fig.7 Plots of ΔIRTPas a function of DNA concentration. Buffer: 20 mmol·L-1PBS (pH=7.4); MPA-capped ZnS∶Mn QDs: 20 mg·L-1. MTX: 4 μmol·L-1.

3.7 Mn摻雜ZnS量子點/MTX復合體系的選擇性

生物體液中一些常見離子和生物分子對檢測體系的干擾考察顯示(表1)：在DNA濃度為5 mg·L-1的條件下，0.5倍的Ca2+、50倍的K+、80倍的Na+、0.6倍的Mg2+、10倍的HAS、15倍的葡萄糖、15倍的L-組氨酸(L-His)、15倍的L-甘氨酸(L-Gly)、8倍的L-半胱氨酸(L-Cys)對DNA的檢測無明顯干擾，但高濃度Na+會對檢測體系有一定干擾。由于該體系測定DNA的檢出限僅為0.07 mg·L-1，遠遠低于生物樣品中的DNA的含量，所以生物樣品稀釋后仍然可以測定出DNA，Na+及其他潛在因素的干擾可以通過對生物樣品的稀釋而規避。

表1 生物體液中常見物質對DNA 檢測的干擾

Tab.1 Effect of co-existing substances on the RTP intensity of 5 mg·L-1DNA

Co-existingsubstancesC(co-existingsubstance)/C(DNA)ΔIRTP/%Ca2+0.5-2.8K+50-3.6Na+80+4.5Mg2+0.6+3.4HSA10+2.9Glucose15-2.1L-His15+3.8L-Gly15+1.6L-Cys8+4.8

3.8 實際樣品分析

為進一步驗證MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點/MTX用于實際樣品中DNA痕量測定的可行性，我們進行了人血清和尿液中加標回收實驗，結果如表2所示，加標回收率在96%～107% 之間。因此，所建立的體系在實際樣品的檢測中具有實用性。

表2 加標回收實驗結果

Tab.2 Recovery for the detection of DNA in real samples (Means±s,n=3)

TypeofsamplesDNAspiked/(mg·L-1)Recovery/%Humanurine2.04.096±3102±4Humanserum2.04.0105±3104±4

4 結 論

基于PIET機理，通過MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點與MTX構建了一種痕量檢測DNA的RTP復合體系。在該體系中，MTX可通過靜電作用與MPA包覆的Mn摻雜ZnS量子點形成復合物，并通過PIET作用猝滅Mn摻雜ZnS量子點的RTP。該體系加入DNA后，由于DNA可與MTX形成更穩定復合物，使MTX從Mn摻雜ZnS量子點脫離，MTX與Mn摻雜ZnS量之間的PIET過程受阻，所以Mn摻雜ZnS量子點的RTP恢復。該方法檢測DNA的線性范圍為0.1～20 mg·L-1，最低檢出限為0.07 mg·L-1，并可用于生物體液中DNA的檢測。該方法一方面是以磷光量子點作為光學基質，可有效避免生物體液中背景熒光和散射光的干擾，同時不需要加入任何除氧劑和誘導劑，避免了復雜的樣品預處理過程；另一方面以MTX作為DNA的特異識別體，有效地增加了檢測過程的選擇性。

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司芳瑞(1988-)，女，山西臨汾人，碩士研究生，2011年于山西師范大學獲得學士學位，主要從事分子化學的研究。

E-mail: 137997253@qq.com

苗艷明(1982-)，男，山西長治人，博士，2015年于山西師范大學獲得博士學位，主要從事生態學及分子化學等方面的研究。

E-mail: mym8207@126.com

閆桂琴(1956-)，女，山西臨猗人，教授，博士生導師，2001年于西北大學獲得博士學位，主要從事植物分子生物學及生物分子化學等方面的研究。

E-mail: gqyan2012@126.com

Detection of DNA Based on Manganese-doped ZnS Quantum Dots/MTX Composite System

SI Fang-rui, MIAO Yan-ming*, YANG Mao-qing, YAN Gui-qin*

(ColledgeofLifeScience,ShanxiNormalUniversity,Linfen041000,China)*CorrespondingAuthors,E-mail:mym8207@126.com;gqyan2012@126.com

A simple phosphorescent compound system for DNA detection was established by utilizing Mn (covered with 3-hydracrylicacid (MPA)) doped with ZnS quantum dots and mitoxantrone. By taking MTX as good electron acceptor, the room temperature phosphorescence (RTP) of Mn-doped ZnS quantum dots were quenched through photoinduced electron transfer principle. After the addition of DNA in system, DNA and MTX were combined through static electricity and intercalation, and a more stable compound was formed as well, which enable MTX removing from the surface of Mn-doped ZnS quantum dots and achieving RTP recovery of Mn-doped ZnS quantum dots. Thus, the trace detection of DNA was realized. The linear scope of this system for DNA detection and the detection limit is 0.1-20 mg·L-1and 0.07 mg·L-1, respectively. This method can effectively avoid the interference from other coexisting substances, which can be used in rapid detection of DNA content in practical biological sample.

quantum dots; phosphorescence; detection; DNA; mitoxantrone

1000-7032(2016)01-0013-09

2015-10-11；

2015-11-13

O482.31

A

10.3788/fgxb20163701.0013