進化工程選育乙醇發(fā)酵酵母菌株研究進展

柳洋，湯曉玉，劉義，任小利，4，丁文武*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039；2.四川大學水利水電學院，四川成都610065；3.農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所，四川成都610041；4.四川省質(zhì)量技術(shù)審查評價中心，四川成都610031）

進化工程選育乙醇發(fā)酵酵母菌株研究進展

柳洋1，2，湯曉玉3，劉義1，任小利1，4，丁文武1*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039；2.四川大學水利水電學院，四川成都610065；3.農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所，四川成都610041；4.四川省質(zhì)量技術(shù)審查評價中心，四川成都610031）

優(yōu)良的酵母菌能夠增強產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率、提高生產(chǎn)效率，因此選育性能優(yōu)良的酵母菌一直是乙醇發(fā)酵中非常重要的工作；該文對利用進化工程選育釀酒酵母菌的研究進展進行了綜述，并展望了其研究趨勢，以便為這一領(lǐng)域的進一步深入研究提供參考和借鑒。

進化工程；酵母菌；乙醇；選育

酵母菌種是乙醇發(fā)酵工藝中最為關(guān)鍵的因素之一，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的酵母菌能夠增強產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率、提高生產(chǎn)效率，因此選育性能優(yōu)良的酵母菌是貫徹乙醇發(fā)酵始終而又十分重要的工作。

隨著能源危機的日益加深，尋找可替代化石能源的可再生能源是世界各國科研工作者所面臨的重要任務(wù)之一[1-2]。在眾多研究中，燃料乙醇被認為是最有可能替代化石能源的可再生能源之一，但是在一些復(fù)雜發(fā)酵環(huán)境或者特殊的發(fā)酵工藝中，并不能利用普通酵母菌來進行發(fā)酵（如纖維素乙醇發(fā)酵）。由于酵母菌并不能直接利用纖維素產(chǎn)生乙醇，因此許多研究便開始利用各種科技手段來篩選能夠直接發(fā)酵纖維素或者纖維素分解產(chǎn)物產(chǎn)乙醇的酵母菌；但是由于纖維素的分解產(chǎn)物非常復(fù)雜，從而形成了特殊的環(huán)境壓力而導(dǎo)致酵母菌對纖維素產(chǎn)物的利用率非常低，因此在尚未弄清酵母菌株為應(yīng)對這種環(huán)境壓力而發(fā)生的有關(guān)分子方面變化的情況下，利用進化工程被認為是篩選適合特殊發(fā)酵環(huán)境的酵母菌的有效手段之一。

本文將對近年來利用進化工程篩選酵母菌的研究情況進行總結(jié)和探討，以使研究者更為方便地了解這一領(lǐng)域的研究進展，并為其研究提供參考和借鑒。

1 進化工程選育酵母菌的研究現(xiàn)狀

進化工程是為了獲得某個既定表型菌株，在一系列選擇措施的基礎(chǔ)上進行的連續(xù)進化措施[1]，即通過模擬自然進化中的生物變異和選擇過程，在人工提供選擇壓力的條件下使微生物進化，然后從進化的菌群中篩選出性狀優(yōu)良的菌株的方法[2]。

由于揭示潛在的表型提高機制變得空前簡單，新生代的序列測定使得進化工程再次得到飛速發(fā)展，也使得發(fā)酵工藝通過發(fā)酵條件和額外的選擇循環(huán)次數(shù)得到了進一步的提高；進化工程的發(fā)展前景也激發(fā)了新選擇方案的發(fā)展，如產(chǎn)量選擇、微流法選擇胞外代謝產(chǎn)物等，這些無疑都將在不久的將來進一步得到發(fā)展和提高；此外，最近的研究結(jié)果也證實了一種觀點—代謝工程無法證實選擇發(fā)現(xiàn)機制，也正是如此，未來進化工程將會變得越來越重要[3]。目前，生物工程中主要是利用進化工程對菌株進行改進，以擴大其底物利用范圍、提高產(chǎn)品生產(chǎn)能力或者提高菌株對環(huán)境壓力的耐受性以提高其特定環(huán)境下的發(fā)酵性能。

1.1 進化工程選育發(fā)酵戊糖類的酵母菌

由于釀酒酵母菌不能以戊糖作為發(fā)酵底物來生產(chǎn)乙醇，但是以纖維素生產(chǎn)乙醇具有巨大的發(fā)展前景和優(yōu)勢，這使得人們不斷尋找或構(gòu)建能夠利用木糖發(fā)酵的微生物，目前雖然已經(jīng)成功構(gòu)建了利用木糖的釀酒酵母菌，但是經(jīng)過改造重組得到的菌株轉(zhuǎn)化木糖的能力較低，由于酵母菌代謝木糖的機理尚未弄清，研究者便開始設(shè)計利用進化工程來選育木糖或乳糖代謝能力強、乙醇產(chǎn)量高的進化菌株[4-13]。

目前這一方向的研究也基本分為兩類，一是注重菌株發(fā)酵能力的提高，通過各種進化措施提高菌株的底物利用能力、細胞量以及產(chǎn)乙醇能力，而對菌株發(fā)生適應(yīng)性進化的機理卻并未進一步深入研究[4-6]，這類研究大都是集中在利用進化工程選育菌株的早期；DEMEKE M M等[4]經(jīng)過多輪復(fù)雜D-木糖培養(yǎng)基的進化工程選育了一株突變菌株，該菌株完全消耗35 g/L的D-木糖需要17 h，消耗速率為1.1 g/（h·g）干細胞，能夠生產(chǎn)比母本菌株多32%的乙醇。LIU E等[5]通過脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重組技術(shù)、化學突變以及適應(yīng)性進化構(gòu)建了一株酵母菌，以希望找到能夠有效利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株，通過實驗，構(gòu)建出的菌株的生長密度、木糖利用率以及產(chǎn)乙醇能力都有了很大的提高；ZHOU H等[6]以進化工程為基礎(chǔ)設(shè)計了經(jīng)過一系列間歇有氧、無氧培養(yǎng)以及木糖限制恒化器培養(yǎng)的實驗，得到一株生長速率（0.203±0.006）h-1、木糖消耗速率1.866 g/（L·h）、乙醇轉(zhuǎn)化率0.41 g/g的酵母菌株。

第二類是通過一定進化方案使得酵母菌有了性能提高，得到進化菌株后，又對酵母菌的進化機理做了進一步的研究[7-13]。HONGA K K等[7]利用一個水準系統(tǒng)檢測酵母菌利用半乳糖的代謝變化，這種代謝變化是由于酵母菌因適應(yīng)性進化而提高的比生長速率以及與此相關(guān)的表型特征的變化而導(dǎo)致的，從而篩選得到了3株比生長速率和比半乳糖吸收率都較高的進化菌株，與工程菌和參照菌相比，進化菌株的半乳糖中間代謝路線與它們相似，盡管在進化菌株中存貯的碳水化合物有所提高且一個進化菌株的麥角固醇的生物合成也發(fā)生了變化；CADIéRE A等[8]在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)利用進化工程增大磷酸戊糖途徑的通量以增強葡萄糖的消耗能力，基于葡萄糖的13C代謝路徑分析，進化菌株的碳通量已經(jīng)從葡萄糖酵解轉(zhuǎn)換到磷酸戊糖酵解途徑上了，并且與原菌株相比，通過磷酸戊糖的通量由原來的11%提高到了17%；LEE K S等[9]通過反代謝工程將寬基因組干擾圖庫引入酵母菌中，然后用3種不同的富集方法得到了能夠快速發(fā)酵半乳糖的轉(zhuǎn)化菌株，并對能夠迅速提高酵母菌性能的編碼基因做了分析；SANCHEZ R G等[10]利用進化工程對攜帶外來基因的重組釀酒酵母菌進行選育，以提高其利用木糖和阿拉伯糖的利用率；經(jīng)實驗，進化菌株在無氧和有氧條件下均表現(xiàn)出了較高的木糖和阿拉伯糖利用率，這也是第一次以分子機制為特征對進化工程提高混合五碳糖利用率的報道；WISSELINK H W等[11]也在前期研究基礎(chǔ)上，在利用代謝工程和進化工程篩選出阿拉伯糖發(fā)酵菌株后，對進化菌株在代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學以及代謝途徑等方面做了深入分析研究。SCALCINATI G等[12]構(gòu)建了一株能夠表達來自于畢赤酵母的木糖還原酶、木糖醇脫氫酶以及木糖激酶的酵母菌株，并用定向進化手段來提高木糖的利用率，該菌株能夠消耗木糖并快速生長卻只產(chǎn)生細胞和幾乎可極少的副產(chǎn)物，通過對該酵母的轉(zhuǎn)錄圖譜的研究發(fā)現(xiàn)，酵母呼吸機制中的乙酸途徑得到了加強；RIN K S等[13]通過合理的代謝和反代謝工程，選育出能夠快速有效發(fā)酵木糖的酵母菌，然后通過幾輪關(guān)于木糖次代培養(yǎng)物的培養(yǎng)，選育出進化菌株，該菌株能夠縮短遲滯期強化木糖發(fā)酵，通過對進化菌株的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，PHO13發(fā)生了突變，失去了Pho13p的相關(guān)作用。

由于底物的多樣性以及發(fā)酵環(huán)境的不同，酵母菌的進化也不同，因此其進化機理的研究也極為復(fù)雜，研究者在這方面研究也多種多樣，但是，從目前的研究來看，主要集中在以下三個方面：（1）胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化，借以推斷菌株代謝路線的變化；（2）通過進化菌株和原始菌株的基因序列分析，借以分析進化菌種中基因的變化；（3）通過分析進化菌株的轉(zhuǎn)錄圖譜，分析菌株中轉(zhuǎn)錄基因表達及相關(guān)作用的變化。

1.2 進化工程選育耐環(huán)境壓力的酵母菌

酵母菌在發(fā)酵過程中面臨這種各種各樣的環(huán)境壓力，這些環(huán)境壓力由各種各樣的因素共同構(gòu)成（如發(fā)酵副產(chǎn)物、重金屬），此外目前作為發(fā)酵底物的纖維素水解產(chǎn)物也包含著許多副產(chǎn)物（如乙酸、呋喃及其衍生物等），都是對酵母菌產(chǎn)生抑制的重要因素，酵母菌在這些抑制因素構(gòu)成的發(fā)酵環(huán)境中，必然會發(fā)生一系列不同的進化以適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境[14]。

GILBERT A等[14]在恒濁器中利用進化工程通過檢測反應(yīng)器中的生物量的方法，當發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性菌群代替原有菌群時則進行取樣篩選，從而分離出2株能耐10 g/L乙酸的釀酒酵母菌；CAKAR Z P等[15]采用了培養(yǎng)過程中逐步加大選擇壓力以及恒定溫和的選擇壓力的兩種方法，在試管中以分批培養(yǎng)的方法對菌株進行進化培養(yǎng)，獲得了能夠抵抗多重環(huán)境壓力的進化株，其對氧化、凍融、高溫和乙醇等不利條件的耐受性，分別是出發(fā)菌株的1429、102、89和62倍；YANG J等[16]利用整體轉(zhuǎn)錄機制工程（global transcriptional machinery engineering，gTME）構(gòu)建了能夠耐乙醇的酵母菌，在20%的葡萄糖發(fā)酵液的24 h實驗中，所篩選出的兩個菌株的生長情況很好，能夠生產(chǎn)出比原來菌株多25%的乙醇，其比產(chǎn)率分別是0.31 g/g和0.39 g/g，產(chǎn)率分別是2.6 g/（L·h）和3.2 g/（L·h），證明了利用gTME選育出的耐乙醇的菌株可以提高乙醇的生產(chǎn)；HONGA M E等[17]利用反代謝工程辨別能夠提高釀酒酵母菌耐乙醇的內(nèi)源基因，對鑒別出的基因進行了詳細的研究，揭示了有助于理解和設(shè)計代謝工程潛在耐乙醇表型的目標基因；WRIGHT J等[18]也利用了進化工程選育了能夠耐乙酸的木糖發(fā)酵菌株，經(jīng)過400代的選育，相繼連續(xù)的間歇培養(yǎng)物和連續(xù)培養(yǎng)物能夠在pH值為4的條件下，耐受乙酸質(zhì)量濃度分別達到6 g/L和5 g/L，木糖消耗速率提高了75%，達到了1.7 g/（L·h）；ZELLE R M等[19]在研究中指出缺乏丙酮酸羧化酶的酵母菌不能利用葡萄糖，除非在培養(yǎng)液中加入C4成分，但是，經(jīng)過進化工程后的突變株卻能夠在以葡萄糖為唯一碳源的情況下利用葡萄糖，因此在研究中ZELLE R M利用突變株和參照株研究了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶能否取代丙酮酸羧化酶所空缺的作用以及取代的條件；WENGER J W等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)酵母菌在其他限碳環(huán)境而無論是有氧還是無氧條件下進化時，在需氧葡萄糖限制時表現(xiàn)出了很少見的“權(quán)衡”（trade-offs）現(xiàn)象；ADAMOGM等[21]也利用了實驗室進化來提高酵母菌耐銅金屬的能力，經(jīng)過實驗，酵母菌的耐CuSO4的能力達到了2.5 g/L，并且發(fā)現(xiàn)了耐銅金屬不同的機制，包括銅吸收的控制、氧化應(yīng)激反應(yīng)的酶水平的變化以及結(jié)合銅蛋白質(zhì)組的變化等。Kü?üKG?ZE G等[22]利用進化工程在鎳壓力水平漸增條件下，選育了能夠抵抗參照菌株致死量5.3 mmol/L NiCl2的高抵抗鎳的突變酵母菌株，而且突變株還可以交叉抵抗鐵、鈷、鋅以及錳等，積累抵抗量比參照菌株抵抗鎳量的兩倍還多，通過全基因組分析，在菌株中發(fā)現(xiàn)了有關(guān)于鐵穩(wěn)態(tài)、壓力響應(yīng)以及氧化損傷等640個等增量調(diào)節(jié)基因，說明鎳抵抗機制同樣可以響應(yīng)常規(guī)壓力，抵抗鐵、鈷以及氧化損傷等環(huán)境壓力；纖維素生物材料在水解過程中會產(chǎn)生多種糖類以及抑制因子；ALMARIO M P等[23]利用進化工程設(shè)計了實時可見進化法，分離出強適應(yīng)纖維素生物材料水解產(chǎn)物的突變菌株，并揭示了酵母菌適應(yīng)該水解產(chǎn)物的分子機制，研究顯示最佳突變株的相對適應(yīng)系數(shù)高于其母本菌株的57%，而且突變菌株對不同的抑制因子表現(xiàn)出了不同的抵抗機制，某些菌株的葡萄糖的吸收率也有所增加，顯示出菌株對復(fù)雜纖維素水解產(chǎn)物的適應(yīng)本性，其轉(zhuǎn)錄組學分析顯示出一些突變菌株抵抗復(fù)雜水解產(chǎn)物的不同機制，以及菌株對氧化壓力和耐水解產(chǎn)物的交叉適應(yīng)性；GUADALUPE-MEDINA V等[24]利用進化工程選育出缺乏三磷酸降解酶、減少醋酸鹽生成的酵母菌，加強了無氧高糖濃度條件下菌株的生長，實驗發(fā)現(xiàn)，突變株的甘油生成量比參照菌株大約少10%，而乙醇得率從79%上升至92%，基因分析顯示，增強好氧條件下的滲透耐力，需要一個主要的染色體突變以及一個在生成質(zhì)粒中的厭氧生長基因。ALKIM C等[25]利用利用經(jīng)典的遺傳和基因組寬轉(zhuǎn)錄子，分析了以進化工程選育出的酵母菌抗鈷表型的特征；KOPPRAM R等[26]利用進化工程在間歇培養(yǎng)基和恒化器培養(yǎng)基中，選育出3株能夠忍耐云松水解產(chǎn)物抑制因子的進化菌株，與母本菌株相比，進化菌株的比生長速率提高了2倍，遲滯期下降為原來的一半，發(fā)酵糖的時間也有所縮短。

此外，有學者也利用進化工程選育了適合反復(fù)真空發(fā)酵的釀酒酵母菌，并利用蛋白質(zhì)組學、代謝組學和脂質(zhì)組學對選育出的酵母的適應(yīng)性進化做了詳細分析，取得非常豐碩的研究成果[28-30]，四川大學肖澤儀課題組也膜生物反應(yīng)器乙醇發(fā)酵過程中副產(chǎn)物對發(fā)酵的影響，以利用進化工程選育適合膜生物反應(yīng)器乙醇發(fā)酵的酵母菌，取得了顯著成果[33-34]。

針對響應(yīng)發(fā)酵環(huán)境壓力的進化酵母菌，研究內(nèi)容也基本可分為兩類：一類是針對發(fā)酵產(chǎn)物乙醇或副產(chǎn)物乙酸以及纖維素水解產(chǎn)物等對酵母菌產(chǎn)生的抑制，通過一定的進化措施提高酵母菌株的耐乙醇或乙酸抑制作用的能力[18，23-24，26-36]；另一類是針對發(fā)酵液中的重金屬如銅、鈷、鎳等形成的環(huán)境壓力，設(shè)計一定的實驗方案，逐漸對酵母菌實行馴化，提高酵母菌耐重金屬毒性的能力[21-22，25]，除此還有針對一些特殊的發(fā)酵環(huán)境而進行研究的，如酵母菌面臨的氧化、凍融、高溫等環(huán)境[15]。

以上研究所進行的內(nèi)容和采取的手段也多種多樣，但總結(jié)起來可以歸納為以下幾個方面：（1）細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究，借以研究代謝路徑的變化，（2）是關(guān)鍵酶等蛋白質(zhì)的研究，借以分析細胞為應(yīng)對環(huán)境壓力在關(guān)鍵酶方面的變化，（3）是對細胞內(nèi)的關(guān)鍵基因的分析研究，借以分析細胞在進化過程中，為適應(yīng)環(huán)境壓力而發(fā)生的基因變化，在這些研究中，基本上都運用了生物化學和分子生物學的知識，以代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和基因組學等技術(shù)方法進行研究。

2 總結(jié)與展望

通過文獻報道可以看到，經(jīng)過研究者多年的努力，利用進化工程選育適合一定發(fā)酵環(huán)境的酵母菌這一領(lǐng)域有了很大的進展，也都取得了較好的研究結(jié)果，所獲得的菌株其性能都得到了一定程度的提高，同時，對進化菌株性能的進一步研究，分別在基因、關(guān)鍵酶或代謝途徑都取得了一定的進展，但是這些研究仍然不夠深入，所得結(jié)果往往是初步探索，尤其是在耐環(huán)境壓力的分子機制上的探索，是近年來隨著相應(yīng)的研究技術(shù)的增強才逐步開始快速發(fā)展的，因此需要進一步加強深入，且需要將酵母的表型性能與分子機理相關(guān)聯(lián)，并需要借鑒和比較前人的研究結(jié)果，以便從更深的層次上認識細胞耐環(huán)境壓力的機制，從而為有針對性的菌株選育和發(fā)酵工藝改進奠定基礎(chǔ)。

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[35]張春明，孜力汗，趙心清，等.廢液全循環(huán)工藝中副產(chǎn)物積累對自絮凝酵母生長和乙醇發(fā)酵的影響[J].過程工程學報，2010，10（4）：772-776.

[36]林貝，趙心清，張秋美，等.絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1啟動子區(qū)的克隆和乙醇脅迫下啟動子活性的變化[J].生物工程學報，2010，26（7）：1014-1018.

Research progress on breeding of yeast strains for alcoholic fermentation by evolutionary engineering

LIU Yang1,2,TANG Xiaoyu3,LIU Yi1,REN Xiaoli1,4,DING Wenwu1*
(1.College of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.College of Water Resource and Hydropower,Sichuan University,Chengdu 610065,China; 3.Biogas Institute of Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China; 4.Sichuan Quality and Technical Examination Center,Chengdu 610031,China)

Ethanol productivity and yield could be elevated with super yeast strains during ethanol fermentation,so super yeast strains breeding is always conducted as a very important work in the ethanol fermentation industry all the time.The research progress of the yeast breading by evolutionary engineering were summarized in the article.The trend of the aspect was also discussed to provide references for the researchers in the field.

evolutionary engineering;yeast;ethanol;breeding

TS201.3

0254-5071（2016）11-0026-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.005

2016-07-14

四川省教育廳項目（15ZB0126）；四川省科技支撐計劃項目（15205613）；西華大學校重點科研基金項目（z1420523）；四川省高校重點實驗室開放項目（szjjz015-001）；西華大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（05030153）

柳洋（1995-），男，碩士研究生，研究方向為可再生能源開發(fā)。

*通訊作者：丁文武（1980-），男，副教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵與生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化。