代謝組學技術在煙草研究中的應用進展

王小莉，付 博，趙銘欽，賀 凡，王鵬澤，劉鵬飛

（河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002）

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代謝組學技術在煙草研究中的應用進展

王小莉，付 博，趙銘欽*，賀 凡，王鵬澤，劉鵬飛

（河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002）

摘 要：簡述了作為研究植物生理生化和基因功能新方法的代謝組學在煙草研究中的主要技術流程及其應用現狀，歸納了不同生態環境和不同組織中煙草代謝物差異及產生原因，總結了生物和非生物脅迫及化學誘導處理等條件下的煙草生理生化變化及相關基因功能。最后提出了目前煙草代謝組學研究所面臨的問題，并指出與其他組學整合應用是代謝組學在煙草研究領域的發展趨勢。

關鍵詞：煙草；代謝組學；脅迫；化學誘導；基因功能

代謝組學與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學分別從不同層面研究生物體對環境或基因改變的響應，它們都是系統生物學的重要組成部分。植物代謝組學是21世紀初產生的一門新學科，主要通過研究植物的次生代謝物受環境或基因擾動前后差異來研究植物代謝網絡和基因功能［1-2］。與微生物和動物相比，植物的獨特性在于它擁有復雜的代謝途徑，目前發現的次生代謝產物達20萬種以上［3］。代謝物差異是植物對基因或環境改變的最終響應［4］，因此，對代謝物進行全面解析，探索相關代謝網絡和基因調控機制，是從分子層面深入認識植物生命活動規律的一個重要環節［5-7］。

煙草不僅是重要的經濟作物，同時還是一種重要的模式植物，作為生物反應器在研究植物遺傳、發育、防御反應和轉基因等領域中具有重要意義［8-10］。煙草代謝物非常豐富，目前從煙葉中已鑒定出3000多種［11］，且代謝物理化性質和含量差異較大，給煙草化學及代謝規律研究帶來挑戰。傳統的煙草化學主要集中于研究某一類化學成分或某幾種重要物質，如萜類［12］、生物堿類［13］、多酚類等［14］，這很難全面地系統地闡述煙草代謝網絡。隨著系統生物學的發展，煙草越來越廣泛地被用于基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的研究中，例如采用系統生物學的方法找出目標物質的功能基因和代謝通路，通過基因修飾和田間管理減少有害物質的合成、增加香味物質的積累、培育低危害高香氣品種等等。因此，將代謝組學用于煙草生理生化、基因功能及代謝通路研究中十分必要，而且已經取得了豐碩的成果。本文對代謝組學技術在煙草研究中的應用進行了綜述。

1　煙草代謝組學主要技術流程

植物代謝組學是植物學、有機化學、分析化學、化學計量學、生物信息學、統計學等多門學科的交叉整合，具有整體性、高通量和無偏向性等特點［15］。從分析流程上講可以分為樣品制備、數據采集和數據處理等三大部分。樣品制備包括植物組織或細胞的培養、采集、代謝物的提取和分離等步驟［16］，每個步驟都直接關系到結果的可靠性。

數據采集目前使用最廣泛的技術平臺是具有高通量、高分辨率、重現性好和操作簡單等特點的核磁共振（NMR）和質譜（MS）及其聯用技術，如氣相色譜-質譜（GC-MS）、液相色譜-質譜（LCMS）、毛細管電泳-質譜（CE-MS）聯用等，滿足了代謝組學對盡可能多的化合物進行檢測的目標，根據研究對象性質可選擇合適的分析平臺，如GC-MS主要用于分析易揮發及衍生化的初生代謝物，LC-MS主要用于分析次生代謝物和脂類，CE-MS主要用于分析可離子化的初生代謝物［17］。

另外，所有組學都會產生大量的數據，代謝組學也不例外。代謝組學的數據處理主要包括：原始數據的預處理、統計分析、代謝物及路徑識別和代謝網絡的構建［18］，龐大而復雜的數據處理和信息挖掘過程需要綜合運用多種統計軟件和數據庫，從而得出正確的生物學信息。這是代謝組學的重點和難點，也是其區別于傳統植物化學研究的獨特之處。

2　煙草代謝組學研究進展

2.1 不同生態環境下煙草代謝組學研究

煙草中代謝物的合成與積累易受光照、溫度、降水、海拔、土壤質地等生態因素影響，造成不同地區煙葉中代謝物產生明顯差異，并最終形成了不同生態區煙葉的風格特色和質量差異。通過代謝組學的方法可以深入認識不同生態環境對煙草代謝物合成與積累的影響。

采用GC-MS、CE-MS和LC-MS技術對津巴布韋和國內（云南）煙葉以及國內三個地區（云南、貴州和河南）的煙葉進行脂質組和代謝組學分析，找到了區分各地區煙葉的差異代謝物，并分析了代謝物差異的產生與氣候因子的關系［19-24］。結果顯示，云南煙葉比津巴布韋煙葉富含糖類，但蔗糖、山梨醇、葡萄糖酸和某些氨基酸較少。國內3個地區的鮮煙葉脂質組和代謝組輪廓都有顯著差異，主要表現為高不飽和度的半乳糖脂、磷脂酰乙醇胺、主要的卵磷脂、多酚、氨基酸和多胺含量在云南煙葉中高于貴州和河南煙葉；低不飽和度半乳糖脂、三酰基甘油、具有三羥基長鏈堿基的葡糖神經酰胺、酰化甾醇糖苷在河南煙葉中最高，其次是貴州和云南煙葉。將代謝物和氣候因子進行關聯分析，結果顯示溫度因素至關重要，能夠影響半乳糖脂中脂肪酸的不飽和度和多酚的積累。Zhang Li等［25］和Zhao Y等［26］運用GC-MS技術對不同地區鮮煙葉進行代謝輪廓分析，能很好地區分云南、貴州和河南煙葉，并找到20種差異代謝物，探討了代謝物差異與不同氣候因子間的關系。結果顯示，3個地區的煙葉中代謝物含量有明顯差異，如與三羧酸（TCA）循環相關的有機酸（異檸檬酸、檸檬酸鹽和延胡索酸鹽等）和抗氧化劑（如奎尼酸、綠原酸和抗壞血酸）含量在貴州煙葉中最高。代謝物含量與氣候因子（降雨、日照和溫度）之間的相關性分析表明，干旱有利于糖和氨基酸的積累。Ma D M等［27］基于GC-MS和頂空固相微萃取（HS-SPME）聯用技術對美國、印度和巴西煙葉中的揮發性物質進行分析，差異性代謝物主要有降茄二酮、螺巖蘭草酮、日齊素等。這表明，代謝組學技術適用于煙葉的代謝輪廓分析和不同生態環境下差異代謝物的評估。

2.2 煙草脅迫代謝組學研究

煙草在生長發育過程中不可避免地會受到各種生物和非生物脅迫，如紫外線、旱災、洪澇、高溫、低溫、鹽堿、病蟲害、機械損傷等。這些逆境因素會對煙草的正常生長發育產生不利影響，使煙葉代謝物產生較大差異［28］。植物代謝產物尤其是次生代謝產物是植物在長期生長和進化過程中對周圍生態環境慢慢適應的結果，植物在受到環境變化、機械損傷或病原微生物浸染后，會產生并積累次生代謝產物，用以增強自身的抵抗力［29］，煙草受到各種逆境脅迫時其代謝產物也會發生顯著變化。運用代謝組學的方法研究煙草受脅迫條件下代謝物變化規律已經成為一種切實可行的技術手段。

Choi Y H等［30］運用NMR對正常煙葉和系統獲得性抗性（SAR）煙葉感染煙草花葉病毒（TMV）后進行代謝組學分析，鑒定出煙葉受感染部分產生與抗性相關的5-咖啡奎尼酸、α-亞麻酸類似物、倍半萜和二萜類等防御物質。結果表明，SAR煙葉與正常煙葉相比各代謝物隨時間變化差異明顯，但SAR煙葉和首次被TMV感染的煙葉含有的與抗性相關代謝物并沒有明顯的差異，說明萜類和黃酮類化合物等抗性代謝物的生物合成始于SAR煙葉，黃酮類化合物也在SAR煙葉中誘導產生。Cho K等［31］運用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）分析接種Ppn后煙草代謝物的變化，發現氨基酸、酚類、苯丙素類、脂肪酸類等代謝物差異顯著。Ibá ?ez A J等［32］采用紅外激光解吸電離串聯飛行時間質譜（IR-LDI-oTOF-MS）研究了感染Ppn的煙草的防御反應，分析了生物堿和酚類、游離脂肪酸和氧化脂類、糖類以及植物激素類物質的變化，找到了關鍵代謝物及其代謝途徑，為快速評價煙草感染病毒的生物指征提供了新方法。

鹽脅迫是植物生長過程中面臨的嚴重的非生物脅迫之一［33］，通過進行煙草鹽脅迫下代謝物差異研究，為研究煙草抗逆性提供新思路。Zhang J等［34］采用 NMR對鹽脅迫下煙草的代謝物變化情況進行研究，發現煙草中與新陳代謝相關的化合物主要有40類，包括有機酸、生物堿、氨基酸、糖類、膽堿、嘧啶和嘌呤代謝物等。清楚地檢測到煙草受不同劑量鹽脅迫的代謝物變化軌跡，短時間低劑量的鹽脅迫導致代謝物朝著糖異生方向偏移，同時伴隨消耗嘧啶和嘌呤代謝物；高劑量長時間的鹽脅迫使得滲透物質逐漸積累，如脯氨酸和肌醇，并改變氨基丁酸分路，同時促使莽草酸酯調節的次生代謝中芳香族氨基酸合成增加。這些證據為煙草適應鹽滲透提供了新的視角。

2.3 煙草化學誘導代謝組學研究

植物在生長、發育、生殖等過程中，常常受到外界的物理、化學和生物等因素的影響，而在這些影響因素中，體內外的相關化學誘導劑對植物生育過程的影響非常廣泛。植物僅僅依靠先天免疫性防御病原體攻擊，對具體的應激方式沒有記憶力，但在對植物進行預激活之后，當再次受到脅迫時它便能夠發動強烈的應激反應［35-36］。化學誘導劑對植物生長、發育、生殖的影響大多是通過作用于植物的啟動子來調控植物基因表達和蛋白表達，進而影響植物的生育以及對內外環境的反應［37］。

以往的研究認為植物中只有反式綠原酸，然而在一些受過機械損傷的植物組織中以及暴露于紫外光下的煙葉中，已經發現其順式異構體［38］。Mhlongo M I等［39-40］用不同的植物防御誘導劑——脂多糖、鞭毛蛋白-22、殼聚糖、活化酯和異亞硝基苯乙酮（INAP）處理煙草培養細胞，發現這些結構和功能多樣的誘導劑均能引起綠原酸的積累，包括單酰化和二酰化的咖啡酰奎寧酸（綠原酸，新綠原酸，異綠原酸B和異綠原酸C），提出綠原酸在能動性地參與引發植物防御作用中扮演新角色，首次發現順式新綠原酸的積累，說明煙草植物中存在產生順式綠原酸異構體的生物途徑。

據文獻［41-43］報道，麥角固醇可以激活煙草細胞中的防御基因，從而誘導與防御相關的次生代謝物質產生。Tugizimana F等［44-45］通過多種代謝組學分析平臺考察麥角固醇對煙草細胞代謝物的影響。結果表明，麥角固醇可以改變細胞的新陳代謝，并鑒定出防御性代謝物包括5種萜類化合物（辣椒素、魯比民醛、日齊素、螺巖蘭草酮和馬鈴薯松弛素）、脫落酸（ABA）、植物固醇等。Gaquerel E等［46］研究了煙草受傷和使用蛾誘導劑后代謝物的變化，發現173種代謝物具有統計學差異，其中128種受時間影響，85種受處理方式影響。

鳥氨酸在煙草尿素循環和多胺生物合成中起著重要作用［47-48］，與鳥氨酸的左旋異構體（L-Orn）截然相反，鳥氨酸的右旋異構體（D-Orn）可以積極參與煙草細胞代謝，誘導產生自由態、束縛態和結合態的多胺［49］。Gholami M等［50］采用手性LCMS對氨基酸類物質進行代謝輪廓分析，發現DOrn對左旋精氨酸（L-Arg）有選擇性積累的優勢，外源D-Orn能選擇性使L-Arg調高80倍，而LOrn使所有氨基酸略有增加，說明D-Orn能夠選擇性調控L-Arg和尿素循環。

Madala N E等［51-52］用INAP分別處理高粱和煙草細胞，考察了 INAP誘導后的代謝物分布變化情況。結果表明，INAP能夠誘導代謝物發生可逆變化。高粱細胞比煙草細胞在化學誘導下代謝物變化更協調一致，說明生氰植物和非生氰植物在亞硝基化合物次生代謝方面有差異；推測鑒定出8種代謝物，并指出INAP影響莽草酸途徑、苯丙烷途徑和類黃酮途徑，能促使體內抗氧化環境的產生。

2.4 煙草功能基因代謝組學研究

活性氧和乙烯在確定植物對病原體侵襲是抗性或易感性方面發揮重要作用。為進一步研究其機理，Cho K等［53］對野生煙草和乙烯信號受阻的轉基因煙草（Ein3-AS）進行代謝組學研究，通過接種Ppn研究乙烯信號分子在對抗病原菌侵入時的防御功能。結果顯示，在Ppn作用下煙堿和苯丙烷-多胺綴合物以及它們的中間體，如精氨酸和腐胺的含量在Ein3-AS轉基因植株中低于野生煙草，而半乳糖脂和氧化的游離脂肪酸則相反。

黃酮類在多數植物中通過苯基丙酸類合成途徑進行生物合成［54］，Misra P等［55］將擬南芥轉錄因子 AtMYB12在煙草中表達，促使包括苯基丙酸類合成途徑的基因表達增強，從而使得黃酮類物質增加幾倍。由于增加了蕓香苷的積累，使得轉基因煙草對斜紋夜蛾和棉鈴蟲具有更好的抗性。

Choi H K等［56］和 Halim V A等［57］分別采用NMR和高效液相色譜-光電二極管陣列-質譜（HPLC-PDA-MS）對野生和轉基因煙草（過表達合成水楊酸的基因，含高濃度水楊酸及其糖苷，增加煙草對花葉病毒的抗性）進行代謝組學分析，結果表明，綠原酸和蕓香苷在轉基因煙草中含量比野生煙草中低。這可能是異分支酸和預苯酸途徑競爭所致，而水楊酸（SA）作為信號分子調控綠原酸和蕓香苷的生物合成。

Mungur R等［58］采用傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR-MS）研究谷氨酸脫氫酶（GDH）轉基因煙草。GDH轉基因煙草改變了谷氨酸鹽、氨基酸和碳代謝，這從根本上改變了煙草的生長發育。通過13NH4+對氨基酸碎片進行生物標記來分析GDH表達、谷氨酸鹽和植物表型之間的因果關系和相互影響，發現轉基因煙草的13N標記的氨基酸鹽和氨基酰胺顯著上升，隨著GDH活性的變化，根部和葉中上百個離子豐度發生改變，其中具有生物醫藥意義的有23種。某些氨基酸、有機酸和糖增加，而有些脂肪酸下降，說明轉基因使銨吸收增加。

2.5 煙草不同組織器官代謝組學研究

綠原酸是由肉桂酸和奎寧酸分子衍生物形成的酚類物質，它的積累與植物防御多種脅迫下的生理響應聯系在一起。Ncube E N等［59］研究了煙葉組織和煙草懸浮細胞中綠原酸及其衍生物的代謝差異，共鑒定出19種含有肉桂酸核的代謝物。這些代謝物在煙葉組織和懸浮細胞中的分布明顯不同，說明綠原酸在兩種不同的體系中生物合成途徑有差異，這需要結合轉錄組學和蛋白組學對其進行更深入的研究。

2.6 與其他組學結合應用研究

木質素是次生細胞壁的重要成分，肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）和肉桂醇脫氫酶（CAD）是催化木質素單體生物合成的最后兩個步驟的關鍵酶，現已經證實下調煙草中的CCR會降低木質素含量，而在下調CAD的煙草中木質素結合更多的醛［60-62］。Dauwe R等［63］發現，改變煙草中CCR和CAD兩個基因中任意一個的表達，都會對其轉錄組和代謝組產生深遠的影響。以基因擴增片段長度多態性為基礎的轉錄譜，結合HPLC和GC-MS代謝物圖譜，揭示了木質素單體生物合成的特異轉錄因子和代謝產物，以及木質素單體和其他代謝途徑之間的相互作用的主要網絡。

Lippmann R等［64］采用蛋白質組學和代謝組學相結合的方法研究了煙草懸浮細胞分泌蛋白質的過程。結果顯示在脅迫處理或缺乏誘導子時脅迫相關的蛋白質和代謝物豐度加強，在脅迫防御和細胞再生過程中鑒定出32種蛋白質，腐胺明顯上升。Ferrario-Mery S等［65］研究了煙草中碳氮相關的代謝途徑，整合了該代謝路徑中轉錄組、酶活性及代謝組學的相互關系。通過對NH4+代謝過程中主要代謝物的定量分析，并整合先前關于氮在轉錄方面的知識，分析了谷氨酰胺合成酶在氮代謝過程中的作用，結論是代謝物量的變化與轉錄水平無關，而與轉錄后修飾調節有關。

3　展望

隨著各種分析技術在分辨率、檢測限和準確度等方面的不斷提高，信息生物學的不斷完善以及各組學之間的結合，代謝組學也越來越廣泛地應用于系統生物學的研究之中。從最初的代謝產物分析、單一代謝途徑探索走向與其他組學技術結合，研究特定的生物學問題，共同揭示植物生理活動的奧秘。代謝組學技術在煙草研究方面已經取得了較為豐碩的成果，成為全面地系統地研究煙草在應對外界環境和脅迫條件下的代謝物響應變化的重要手段。但從總體來看，目前煙草代謝組學仍然處于初級階段，在分析技術、數據處理和生物信息整合等方面均面臨著巨大挑戰。

首先是分析技術的局限性。代謝組學的深入研究得益于分析技術的不斷進步，如高分辨質譜（HRMS）、UPLC、NMR、傅里葉紅外（FTIR）、CE及其聯用技術的應用。與其他各組學（基因組學、蛋白質組學等）技術只分析特定類型的物質不同，植物代謝物具有復雜多樣、理化性質差異大、各組織中分布不均等特點，且在時間和空間上都具有高度的動態性［66］，目前還沒有一種能夠無偏向性地分析所有代謝物的技術平臺。

其次是大量數據的分析處理。代謝組學的高通量性、整體性、系統性、動態性的特點決定了研究過程中將產生大量的數據，如何篩選獲取有效數據并對其進行科學解析是一項艱巨的工作，特別是大量代謝物的鑒定。在整合多種統計軟件和數據庫，提高數據處理的效率和準確性方面同樣面臨著巨大挑戰。

最后是代謝組學與其他組學的結合。代謝組學與基因組學、轉錄組學及蛋白質組學是研究系統生物學信息傳遞的幾個層次。代謝組學只揭示發生了什么，而研究生物體發生這些改變的原因和過程，需要將幾個組學結合起來，因此，代謝組學是服務于基因組學的。如何將代謝組學與其他相關組學以及代謝通路整合在一起，并科學地揭示植物的生理功能是能否發揮代謝組學潛能的重點和難點［67］。

我國《煙草行業中長期科技發展規劃綱要（2006—2020年）》中提出，要找到參與煙草抗性、營養吸收、香氣形成、煙堿代謝、有害成分合成與降解、煙葉成熟和烘烤等過程中相關的功能基因和蛋白質，培育出高香氣低危害品種，為中式卷煙的發展提供特色優質煙葉原料。這些工作的推進都離不開對煙草代謝機理的深入認識，只有全面系統地開展煙草代謝組學基本規律研究，并與其他組學整合、驗證，才能更好地指導煙草生產，這是煙草代謝組學未來的發展方向［68-69］。

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Research of Metabolomics in Tobacco

WANG Xiaoli，FU Bo，ZHAO Mingqin*，HE Fan，WANG Pengze，LIU Pengfei
（College of Tobacco Science，Henan Agricultural University，National Tobacco Physiology and Biochemistry Research Center，Zhengzhou 450002，China）

Abstract:Metabolomics has been considered one of the most effective means of investigating physiological and biochemical processes and gene function of plants. Here we review the main process of metabolomics and its application status in tobacco research，the regulation mechanisms of physiological and biochemical reactions when tobacco responds to different environmental，biotic and abiotic stresses，chemically induced processes and genetic modifications. Finally，issues of critical significance to current tobacco metabolomics research are discussed and it is noted that integration with other omics is the trend of metabolomics research in tobacco.

Keywords:tobacco；metabolomics；stress；chemical induction；gene function

中圖分類號：S572.01

文章編號：1007-5119（2016）01-0089-08

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.016

基金項目：中國煙草總公司濃香型特色優質煙葉開發（110201101001 TS-01）；上海煙草集團責任有限公司“濃香型特色優質煙葉風格定位研究及樣品檢測”（szbcw201201150）

作者簡介：王小莉（1983-），女，博士研究生，主要從事煙草生理生化研究。E-mail：xiaoliwang325@126.com*通信作者，E-mail：zhaomingqin@126.com

收稿日期：2015-09-09 修回日期：2015-11-19