苯甲酸降解菌的分離鑒定及其對烤煙幼苗生長的影響

李 鑫，王 豐，周冀衡，李 強，邵建平，趙 杰，王瑞寶，許 計，李亞兵，李 超

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128；2.湖南農業大學煙草研究院，長沙 410128；3.貴州省黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400；4.曲靖市煙草公司羅平縣分公司，云南 羅平 655800）

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苯甲酸降解菌的分離鑒定及其對烤煙幼苗生長的影響

李 鑫1，2，王 豐3，周冀衡2*，李 強2，邵建平4，趙 杰4，王瑞寶4，許 計4，李亞兵4，李 超4

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128；2.湖南農業大學煙草研究院，長沙 410128；3.貴州省黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400；4.曲靖市煙草公司羅平縣分公司，云南 羅平 655800）

摘 要：為降低煙草連作對煙葉產量和品質以及煙草生長發育帶來的不良影響，通過平板篩選和搖床復篩，從烤煙根系分泌物中篩選出一株能高效降解苯甲酸的菌株。結果表明，根據rDNA-ITS的擴增及序列分析、培養特征及形態特征觀察初步鑒定該菌株為黃曲霉（Aspergillus flavus）；該菌株培養15 d內，在0～800 μmol/L苯甲酸濃度范圍內能夠正常生長，800～1600 μmol/L苯甲酸濃度范圍內生長受到一定程度抑制；該降解菌在以苯甲酸為唯一碳源的800 μmol/L濃度LBA培養基中菌株干重、降解率均達到最大，菌株干重為0.765 g，降解率為19.98%；菌株在培養至第9天時降解速率達到最快，為8.5 mg/d；烤煙幼苗生長過程中施加降解菌液能在一定程度上降低根系分泌物的抑制作用。該降解菌株在盆栽試驗中能夠降低根系分泌物對烤煙的自毒作用，使微生物菌株降解烤煙自毒物質來克服連作障礙成為可能。

關鍵詞：烤煙；苯甲酸降解菌；分離鑒定；連作障礙

鑒于我國農田種植制度、土地流轉方式及經濟效益方面的考慮，煙草連作障礙依然普遍，已成為制約我國煙草農業發展的障礙之一［1-4］。烤煙根系在生長過程中會分泌一些有害物質，在土壤中積累到一定程度時會抑制烤煙本身及其他作物的生長，同時導致土壤理化性狀惡化、土傳病害日趨嚴重。烤煙根系分泌物釋放的煙堿、水楊酸、苯甲酸、2-羥基丙酸等［5-6］均可降低植煙土壤利用率和煙葉品質。有研究報道，采用作物輪作［7］、施用土壤改良劑［8-9］和微生物肥料等［10］方法，可以緩解由于營養元素失衡和土傳病害增多引起的連作現象，但關于烤煙自毒物質的生物可降解性報道還不多見，只有毛寧等［11］、苗艷芳等［12］和周治等［13］對植物根系分泌物降解菌有少許研究。上述研究主要針對細菌和放線菌，關于真菌的研究較少，尤其真菌對苯甲酸降解效果研究未見報道。本研究針對烤煙連作自毒作用的生物降解菌進行分離篩選，對分離的菌株進行分子生物學鑒定，并進行盆栽試驗驗證其降解效果，進一步探討利用微生物菌株降解烤煙自毒物質的可行性，為烤煙連作障礙修復提供科學依據。

1　材料與方法

1.1 供試培養基

真菌培養選用馬丁氏培養基，活化培養及保存方法參照文獻［14］以苯甲酸為唯一碳源真菌培養基：磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，1/300孟加拉紅水溶液3 mL，pH自然，定容至1 L，固體培養基用于降解苯甲酸真菌的篩選；液體培養基分裝后，加入苯甲酸，使苯甲酸的終濃度分別為400（設為T1）、800（T2）、1200（T3）、1600（T4）及2000（T5）μmol/L，用于真菌對苯甲酸降解測定。

1.2 真菌的分離與純化

真菌按照常規方法進行分離和純化［15］：按照文獻［16］方法制備烤煙根系分泌物，取1 mL烤煙根系分泌物均勻涂布于馬丁氏培養基中，28 ℃黑暗條件下培養7 d。在菌落形成后挑取單個菌落置于以苯甲酸為唯一碳源的固體真菌培養基中，28 ℃黑暗條件下培養。待長出單菌落后，挑取單孢純化，純化后的菌株保存于LBA培養基斜面上，置4 ℃冰箱中保存備用。

1.3 真菌鑒定

1.3.1 形態學鑒定 將分離純化得到的真菌接種到LBA平板上，28 ℃黑暗培養，觀察菌落形態；7 d后從平板上挑取少量菌絲進行鏡檢，觀察孢子形態及其產生方式。

1.3.2 rDNA-ITS擴增及序列分析 將分離得到的真菌接種于LBA培養基中，在28 ℃黑暗條件下培養3 d。用滅菌牙簽挑取少量菌絲用于DNA提取。DNA提取參照Lee等［17］的方法。利用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS1（5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?）和 ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）對病原菌的rDNA-ITS區進行PCR擴增［18］。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環；最終72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，測序結果在GenBank數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行BLAST比對分析。

1.4 降解菌液對烤煙幼苗生長的影響

幼苗生長試驗于2013年8月至2013年10月，在貴州省煙草科學研究院人工大棚中進行，采用常規育苗盤育苗，育苗基質由云南省丘北縣煙用物資有限責任公司提供。8月1日開始播種，育苗15 d后間苗（8月15日），間苗后每穴留有1株煙苗，后向育苗盤中每天下午澆入50 mL相應處理液，連續灌澆45 d，含有降解菌的處理液在澆入前12 h即在常溫下混勻。采用隨機區組設計，共設3個處理液處理，每個處理3個重復（即3盤幼苗），每個重復12株煙苗。3個處理中M1處理為自來水設為CK，M2處理為烤煙根系分泌物，M3處理為降解菌液和烤煙根系分泌物的混合液。M3處理的混合處理液以降解菌液5 mL，分泌物45 mL進行分配。待幼苗生長60 d（10月1日）后測量其根系結構、葉綠素含量和光合特性等各類指標。

1.5 測定項目

1.5.1 降解菌干重和苯甲酸降解速率測定 在馬丁氏培養基中取5 mm降解菌菌絲塊無菌操作移到T1-T5等5個以苯甲酸為唯一碳源濃度處理溶液培養基中進行培養，每個處理3個重復，連續培養15 d。在降解菌培養至15 d時取出降解真菌，過濾、干燥（60 ℃，2 h）、稱量，同時每隔3 d測量一次不同濃度LBA培養基中苯甲酸含量，連續測量15 d。苯甲酸含量測定采用文獻［19］方法測量，并稱量。

1.5.2 烤煙幼苗生長相關生理指標測定 選取長相一致具有代表性的煙苗根系，采用 WinRHIZO植物根系掃描分析系統（北京易科泰生態技術有限公司）測定幼苗根系結構。采用Li-6400XT便攜式光合作用測定儀和6400-02B紅藍光源（美國Li-cor公司）測定幼苗光合指標。采用丙酮提取-TU1901紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）測定幼苗葉綠素各類指標。

試驗數據采用Microsoft Excel 2003軟件進行處理，采用SPSS18.0軟件進行差異顯著性分析。

2　結果

2.1 降解菌株鑒定

2.1.1 降解菌株的菌落形態特征觀察 降解菌在LBA培養基上生長良好，菌落生長較快，結構疏松，表面灰綠色，背面無色或略呈褐色（圖1-D）。菌體有許多復雜的分枝菌絲構成（圖1-A）。營養菌絲具有分隔；氣生菌絲的一部分形成長而粗糙的分生孢子梗，頂端產生燒瓶形或近球形頂囊（圖1-C），表面產生許多小梗，小梗上著生成串的表面粗糙的球形分生孢子（圖1-B）。具典型的黃曲霉形態特征。

2.1.2 菌株 Z5序列測定 采用真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4對該菌株進行rDNA-ITS的PCR擴增，經測序分析該菌株 ITS序列片段長 589bp （Genbank收錄號為KT633952）。BLAST分析表明，該菌株的 rDNA-ITS序列與 GenBank中FJ878681、HQ340108、HQ340103、HQ340101等黃曲霉序列的相似性最高，達到99%。

圖1　降解菌的菌落和形態學特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of the acid-degrading bacterium

綜合上述的形態學觀察及ITS序列數據，將該降解菌初步鑒定為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）。

2.2 菌株對苯甲酸降解的影響

2.2.1 不同濃度苯甲酸對菌株干重的影響 圖 2可知，降解菌株在苯甲酸溶液中經過15 d培養后干重隨濃度的增加呈先增大后降低的趨勢。苯甲酸干重在T2處理中達到最大，為0.765 g，與其他處理差異顯著；在T3、T4和T5處理濃度中干重顯著降低，且3個處理間無顯著性差異。

2.2.2 菌株對苯甲酸降解速率的影響 圖3可知，降解菌在T1和T2處理濃度下苯甲酸的降解速率呈先上升后降低的趨勢，在第9天時降解速率達到最大，分別為2.7和8.5 mg/d，然后逐漸降低，在第15 d時兩個濃度處理下苯甲酸的降解速率趨于相同，分別為1.31和1.2 mg/d，其他處理濃度下基本不降解。

圖2　不同濃度苯甲酸溶液對降解菌干重的影響Fig. 2 Effects of benzoic acid solution at different concentrations on dry weight of degrading bacteria

圖3　降解菌對苯甲酸溶液降解速率的影響Fig. 3 Effect of degrading bacteria on the degration rate of benzoic acid

2.3 降解菌液對烤煙幼苗根系結構的影響

表1可知，各處理間以M1處理的烤煙幼苗根系生長最好，與M2和M3處理的各類根系結構指標有顯著性差異；M2與M3處理除總根表面積有顯著性差異，其他指標均無顯著性差異，但M3處理烤煙根系生長優于M2處理。說明，根系分泌物中加入降解菌后能夠在一定程度上降低根系分泌物對烤煙根系生長的抑制作用。

2.4 降解菌液對烤煙幼苗葉綠素含量的影響

表2可知，灌澆不同處理液后對烤煙幼苗生長過程中葉綠素含量的影響不同。其中，M1處理較M2和M3處理在葉綠素各類指標中均為最大，且差異性顯著，M2和M3處理間雖無顯著性差異，但M3處理葉綠素含量有高于M2處理的趨勢。

2.5 降解菌液對烤煙幼苗光合特性的影響

表3可知，含有降解菌處理液的M3處理能夠減緩根系分泌物對烤煙生長過程中光合特性的抑制作用。各處理間光合特性以 M1＞M2＞M3，M1處理與M2和M3處理間呈顯著性差異，M2 和 M3處理的凈光合速率呈顯著性差異，但氣孔導度、蒸騰速率以及胞間CO2濃度無差異或差異不顯著。

表1　不同處理對烤煙幼苗根系結構的影響Table 1 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco roots

表2　不同處理對烤煙幼苗葉綠素含量的影響 mg/gTable 2 Effects of different concentrations on flue-cured tobacco chlorophyll content

3　討論

表3　不同處理對烤煙幼苗光合特性的影響Table 3 Effects of different concentrations on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco

烤煙根系分泌物造成的烤煙連作障礙是近年來我國主要植煙區遇到的常見問題，連作障礙往往會導致病蟲害加重、土壤次生鹽漬化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破壞等［20］。Asao T等［21］認為導致烤煙連作障礙的一個重要原因是由于本身的自毒作用，由于連年種植，導致烤煙根系會分泌一些自毒物質并積累，達到一定程度會抑制烤煙生長。化感物質可以對受體植物的細胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反應產生影響［22］。筆者從烤煙根系分泌物中分離出一株能夠降解苯甲酸的菌株，采用形態學觀察和rDNA-ITS的擴增及序列分析對其進行鑒定，初步將其鑒定為黃曲霉（aspergillus. flavus），并對其降解效果進行了研究。研究結果對解決當前植煙土壤連作障礙有一定的現實意義。

關于苯甲酸降解菌的研究并不多見，方艷芬等［23］采用富集培養法從廢水中分離到能以苯甲酸為唯一碳源和能源的菌株LS01，在最適宜條件下，菌株的降解率能達到85%以上；蔡寶立等［24］用富集培養法從工業污水中分離出不動桿菌（Acinetobacter sp.）BJ1、無色桿菌（Achromobacter sp.）BY1、假單胞菌（Paesdomonas spp.）SJ1、SY1 和SH1等5株能夠降解苯甲酸的微生物，在最適條件下BJ1菌株對苯甲酸的降解率達到98%以上。苯甲酸是多種芳香化合物生物代謝的中間產物，研究發現，好氧微生物降解苯甲酸主要通過鄰位代謝途徑、間位代謝途徑［25］以及苯甲酰輔酶A和3-羥基苯甲酰輔酶A代謝途徑［26］，分別將苯甲酸分解為生理反應各階段中間物質。國內外未見黃曲霉具有這種降解特性的報道，其降解機理有待進一步研究。

黃曲霉（Aspergillus flavus）對苯甲酸的降解效果研究表明，黃曲霉在以苯甲酸為唯一碳源在800 μmol/L濃度時生長條件最佳，苯甲酸降解率可達19.98%，在第9天時降解速率最快。進一步將黃曲霉培養后與烤煙根系分泌物混合施加到育苗盤中進行烤煙幼苗培養，能減輕根系分泌物對烤煙幼苗根系結構、葉綠素含量以及光合特性等指標的抑制作用，說明根系分泌物中施加降解菌液一定程度上弱化根系分泌物對烤煙幼苗的化感效應。與本研究結果相似，胡春江等［27］研究發現，在土壤中施加微生物修復菌物可以有效減輕作物連作障礙。上述研究結果表明微生物降解作物自毒物質，有助于克服連作障礙。此外，本文只研究了一種降解菌液與烤煙根系分泌物混合對烤煙幼苗生長的影響，要解決大田烤煙連作障礙，還需進一步分離鑒定更多根系分泌物降解菌株并進行大田試驗研究。

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Isolation and Identification of a Benzoic Acid-degrading Bacterium and Its Effect on Growth of Flue-cured Tobacco

LI Xin1，2，WANG Feng3，ZHOU Jiheng2*，LI Qiang2，SHAO Jianping4，ZHAO Jie4，WANG Ruibao4，XU Ji4，LI Yabing4，LI Chao4
（1. College of BIological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2. College of Tobacco Research，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；3. Southwest of Guizhou Company，Xingyi，Guizhou 562400，China；4. Luoping County Branch of Qujing City，Luoping，Yunnan 655800，China）

Abstract:In order to reduce adverse effects of continuous cropping on yield and quality to some extent，as well as growth and development of flue-cured tobacco，the authors isolated a benzoic acid decompositon strain from the root exudate of tobacco by plate screening and shaker rescreening. The strain was identified as Aspergillus according to rDNA-ITS and sequence analysis，culture characteristics and morphological characteristics. The results showed that the strain could grow normally in the 0-800 μmol/L benzoic acid concentration range in 15 days. To certain extent the strain’s growth was constrained in the 800-1600 μmol/L benzoic acid concentration range. When using benzoic acid as the sole carbon source at the concentration of 800 μmol/L，dry weight and degradation rate of the strain reached the maximum on LBA medium. The dry weight of the strain was 0.765 g and the degradation rate was 19.98%. The degradation of the strain reached the highest rate which was 8.5 mg/d on the ninth day. To some extent，application of the degradation strain could reduce the the hazard of benzoic acid in root exudates of flue-cured tobacco. The degradation strain can reduce the toxic effect of root exudates in a pot experiment，it then can potentially be used to degrade the self poison substance to overcome the continuous cropping obstacle.

Keywords:flue-cured tobacco；benzoic acid-degrading bacterium；isolation and identification；continuous cropping obstacle

中圖分類號：S345.72

文章編號：1007-5119（2016）01-0072-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.013

基金項目：中國煙草總公司項目“土壤微生物生態修復關鍵技術研究與應用”（11020100219）；湖南省研究生科研創新項目“基于烤煙土壤-根系互作機制的煙葉鉀素調控技術研究”（CX2015B238）

作者簡介：李 鑫（1989-），男，在讀博士，研究方向：煙草生物科學與工程技術。E-mail：s2007203272@yeah.net*通信作者，E-mail：jhzhou2005@163.com

收稿日期：2015-06-22 修回日期：2015-11-04