鴨腸炎病毒基因研究現(xiàn)狀

杜翔宇，胡桂學(xué)，董浩

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

鴨腸炎病毒基因研究現(xiàn)狀

杜翔宇1，胡桂學(xué)2，董浩1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

鴨病毒性腸炎具有流行廣、傳播快，發(fā)病率和死亡率高等特征［1］，自1923年首次報道該病以來，世界多個國家都先后有此病暴發(fā)的報道，對養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最為嚴重的傳染病之一。鴨病毒性腸炎對不同性別和年齡的鴨均可致病，對成年鴨的危害最為嚴重，其特征為侵害血管、消化道黏膜糜爛、組織出血、淋巴器官病變及其實質(zhì)器官有退行性病變。康復(fù)后的鴨仍可能帶毒和排毒，導(dǎo)致該病在鴨群中廣泛地傳播，嚴重的影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟損失。

Plumme和Hansen等的工作為DEV基因組結(jié)構(gòu)的研究開辟了先河，在1998年P(guān)lummer等首次報道了DEV部分UL6及UL7的基因序列、在1999年Hansen等首次報道了DEV部分UL30基因，此后人們對DEV基因組有了全新認識［2］。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，鴨瘟病毒的分子生物學(xué)研宄也在不斷深入，DEV基因組序列先后被報道，包括TK、gH全基因序列、UL24基因序列［3-5］，與此同時對這些基因的分子特征、結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的功能作出了預(yù)測。眾多皰疹病毒的基因組序列已經(jīng)被測定出來，并且逐漸向基因的相關(guān)特性及功能、鴨腸炎病毒的復(fù)制機理、感染機制、疫苗的制備等方面深入地進行，為深入探索鴨腸炎病毒感染的發(fā)病機理提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

1鴨腸炎病毒的生物學(xué)特性

鴨腸炎病毒是α-皰疹病毒亞科的成員，具有皰疹病毒典型的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且不同毒株之間均可產(chǎn)生交互免疫。病毒粒子為大的球形且?guī)夷さ牟《荆睆綖?20～200 nm，結(jié)構(gòu)主要由衣殼、外膜、囊膜、核心4部分組成。DEV病毒衣殼為二十面體對稱，外觀呈六角形，由162個相互連接呈放射狀排列并且有中空軸孔的殼粒組成，核心是由雙股線狀DNA與蛋白纏繞而成，直徑約為35～40 nm；DEV可以在鴨胚成纖維細胞上增殖且形成核內(nèi)包涵體、也可形成蝕斑，DEV無血凝和血細胞吸附特性。

病毒基因組為線性雙鏈DNA，長度在125 kb～240 kb之間，G+C含量在32%-75%之間。DEV基因組與其他皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)類似，整個基因組分為短獨特區(qū)（Unique Short Region，US），長獨特區(qū)（Unique Long Region，UL），末端重復(fù)序列（terminal repeat，TR）及反向重復(fù)序列（Inverted Repeats，IR）。由于囊膜糖蛋白是皰疹病毒的主要保護性抗原，它們在介導(dǎo)病毒進入細胞，以及病毒的成熟與釋放過程中均起重要的作用，因此對皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中囊膜糖蛋白的研究顯得尤為重要。

2鴨腸炎病毒基因研究現(xiàn)狀

目前共有12個囊膜糖蛋白被命名，其中g(shù)B、gC、gH、gJ、gK、gL、gM、gN由UL區(qū)段編碼，gD、gE、gG、gl由US區(qū)段編碼，各囊膜糖蛋白在病毒感染細胞的病理過程和免疫原性中具有不同的功能。

2.1UL區(qū)基因鴨腸炎病毒基因所編碼的蛋白功能不盡相同，有的在膜的融合中起作用，有的介導(dǎo)病毒與肝素樣受體的結(jié)合，有的參與病毒的穿透過程，介于此關(guān)于鴨腸炎病毒基因部分特性及其原核表達蛋白應(yīng)用的研究被廣泛關(guān)注。陳希文［6］對鴨腸炎病毒UL18基因的部分特性以及原核表達蛋白的應(yīng)用進行了研究，結(jié)果表明，DEV UL18基因大小為969 bp，編碼了由322個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子量為35.25 kD，等電點理論值為8.37，采用實時熒光定量RT-PCR方法和Western Blot技術(shù)檢測病毒感染鴨胚成纖維細胞（DEF）之后DEV UL18基因的轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達情況，推測該基因是病毒晚期基因。潘華奇［7］成功地克隆了鴨腸炎病毒gB基因，并對表達產(chǎn)物的初步應(yīng)用進行了研究，是與其他皰疹病毒具有同源性的DEV UL25，UL26，UL26.5，UL27新基因的序列，分別構(gòu)建了含DEV gB蛋白N端和中部抗原性較好的抗原域編碼基因的兩個原核表達質(zhì)粒，利用Western Blot技術(shù)檢測蛋白，證明擴增基因是DEV所編碼的，并且得知DEV gB蛋白有良好的抗原性，是皰疹病毒囊膜糖蛋白B家族成員。黃杰［8］做了鴨瘟病毒UL7基因生物信息學(xué)的分析，表明DPVUL7基因含1個保守結(jié)構(gòu)域、編碼的產(chǎn)物無跨膜區(qū)和信號肽、具有1個潛在的酰基化位點、12個潛在的糖基化位點和磷酸化位點，對亞細胞進行定位，結(jié)果表明，UL7蛋白主要位于細胞質(zhì)，應(yīng)用Western Blot分析顯示，表達的產(chǎn)物可與兔抗DPV多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，對鴨瘟病毒UL7基因的類型及轉(zhuǎn)錄時相分析，結(jié)果表明，UL7基因是DPV的一個晚期基因。

部分關(guān)于鴨腸炎病毒基因的研究僅見于序列分析及編碼蛋白的歸類，而具體作用及非復(fù)合物形式的蛋白的功能的研究尤為重要。藺萌［9］初步研究了鴨腸炎病毒gN基因及功能，基因大小為288 bp，編碼95個氨基酸，含有2個跨膜區(qū)域和1個信號肽區(qū)。對DEV gN基因的分子特征分析，結(jié)果表明，DEV gN基因具有特異性，可以作為一個區(qū)別DEV與其他病毒的特異基因，同時建立了基于DEV gN基因的PCR擴增檢測方法，并應(yīng)用于DEV的臨床診斷，該檢測方法能特異性地檢出DEV，最低可以檢測到0.1 ng/μL的DEV DNA。姜龍［10］對鴨瘟病毒UL49的基因功能進行研究，分析其生物信息學(xué)，研究表明，DPV UL49基因編碼VP22蛋白，該蛋白由253個氨基酸組成，分子量約為27 864，蛋白大小為575 Da；制備分離兔抗重組VP22蛋白高免血清，效價最高的達到1∶32；應(yīng)用Western Blot檢測其能夠與純化的VP22重組蛋白結(jié)合，具有很強的特異性；研究DPV UL49基因RNA干擾有效靶點的篩選及對病毒重要糖蛋白基因轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果表明，RNAi質(zhì)粒VP22-505可抑制DPV UL49基因轉(zhuǎn)錄，同時對DPV糖蛋白基因gB、gE和gD的轉(zhuǎn)錄也有很強的抑制作用。劉峰源［11］利用Tail-PCR克隆了鴨腸炎病毒完整的gC基因和部分UL43基因的序列，并進行序列測定，gC基因全長1 296 bp，編碼431個氨基酸；利用Western Blot證明，表達的DEV gC蛋白具有良好的抗原性；利用純化重組的gC蛋白，進行淋巴細胞增殖試驗，檢測刺激產(chǎn)生IFN-γ的水平，證明gC基因具有刺激機體細胞免疫的功能。

對鴨腸炎病毒基因缺失株生物學(xué)特性進行初步研究，以期為今后的鴨瘟病毒相關(guān)研究提供參考。孫昆峰［12］選取鴨瘟病毒gC基因作為保護性抗原構(gòu)建基因疫苗，并初步對gC、gE的功能以及相應(yīng)缺失株、對鴨的致病性和免疫的保護作用，證實了gC缺失使鴨癌病毒的滴度下降，促進了感染鴨胚成纖維細胞的融合，降低了病毒的毒力；gC缺失株可誘導(dǎo)較高的中和抗體，可保護免疫鴨免受鴨瘟強毒攻擊。證實gE非鴨瘟病毒復(fù)制必需基因，但gE缺失顯著降低了鴨癌病毒的空斑形成能力和病毒毒力，gE缺失株可以為免疫鴨提供完全保護，有望發(fā)展成區(qū)分人工免疫和強毒自然感染的新型基因工程疫苗。楊承槐［13］對鴨腸炎病毒強毒參考株全基因組序列進行測定與分析，此毒株基因組全長為162 131 bp，共有78個ORF，編碼76個蛋白；DEV經(jīng)雞胚成纖維細胞連續(xù)傳代后可導(dǎo)致gE和gl基因缺失，使其失去對鴨的致病力，DEV CSC經(jīng)雞胚成纖維細胞傳代后致弱的第80代毒有良好的免疫原性；此研究構(gòu)建了缺失gE和gL基因的DEV突變株，gE和gL基因的缺失，可以降低病毒的復(fù)制能力及致病性，DEV gE和gL基因?qū)Σ《驹诩毎g的傳播以及毒力具有重要的影響。

研究鴨腸炎病毒基因在宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況對了解病毒基因的特點和功能有重要意義，可為進一步開展鴨腸炎病毒基因的功能等研究提供基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)。石勇［14］對鴨瘟病毒UL21基因進行了生物信息學(xué)分析、鴨瘟病毒UL21基因全長1 686 bp，預(yù)測編碼561個氨基酸大小的蛋白，理論分子量約62 kD，此蛋白含有3個潛在的糖基化位點、27個潛在的磷酸化位點，無信號肽和跨膜區(qū)域，重組表達的蛋白主要是以包涵體的形式存在，對其進行瓊脂擴散試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最高免疫抗血清效價達到了1∶16，成功地制備了兔抗DPV UL21重組蛋白多克隆抗體，應(yīng)用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法分析其基因轉(zhuǎn)錄時相，證明DPV UL2屬于一個晚期基因。婁昆鵬［15］研究了鴨瘟病毒UL28基因的克隆、原核表達、細胞定位及轉(zhuǎn)錄時相，對鴨瘟病毒UL28基因序列的分子特性進行分析，DPV UL28基因大小為2 412 bp，編碼803個氨基酸，含有1個保守結(jié)構(gòu)域；Westem Blot檢測顯示，可以識別重組表達的蛋白，瓊脂擴散試驗效價達到1∶16～1∶32；轉(zhuǎn)錄時相分析鴨瘟病毒體外感染宿主細胞UL28基因，得知轉(zhuǎn)錄譜具有皰疹病毒早期基因的典型特征。沈愛梅［16］對DEV UL45基因的分子特性分析，該基因大小為675 bp，編碼224個氨基酸，等電點為6.51；免疫印跡結(jié)果表明，制備的抗體能特異性的識別UL45蛋白，并且證明UL45基因是DEV基因組的組成部分；UL45基因編碼蛋白屬性分析結(jié)果表明，該蛋白存在于純化病毒和上清中，推測UL45蛋白是病毒的囊膜蛋白，DEV UL45基因轉(zhuǎn)錄特性研究表明，該基因?qū)儆谕砥诨颉?/p>

2.2US區(qū)基因針對鴨腸炎病毒US區(qū)基因的相關(guān)特性和功能開展初步研究，可為深入了解鴨病毒性腸炎感染的發(fā)病機理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。范薇［17］對鴨瘟病毒gD基因及其重組蛋白的應(yīng)用展開研究，結(jié)果表明，該基因的ORF屬于皰疹病毒gD基因家族，是DPV的gD基因。gD基因編碼區(qū)（ORF）全長為1 269 bp，C+G含量為44%。編碼的gD蛋白含有422個氨基酸，分子量是47.5 kD。獲得了原核表達gD蛋白，并具有免疫反應(yīng)性，經(jīng)全病毒DPV ELISA方法驗證，本研究建立的重組gD蛋白間接ELISA檢測方法與其在檢出率上差異不顯著，可用于臨床血清學(xué)監(jiān)測。信洪一［18］通過基因組文庫首次證實了DEV US3基因，制備高純度的抗DEV US3蛋白IgG，并且利用該方法檢測了20株臨床鴨瘟的陽性樣本，結(jié)果顯示檢出率為100%；成功建立了DEV US3基因原核表達蛋白的間接ELISA檢測抗DEV抗體的方法，結(jié)果表明，最適抗原包被濃度為2.2 μg/mL，最適待檢血清稀釋度為1∶320；最適二抗稀釋度為1∶2 000；臨床結(jié)果顯示，此PCR方法檢出率效果好，可應(yīng)用于臨床檢測DEV。

gE是皰疹病毒復(fù)制非必須的病毒主要毒力基因之一，闡明gE基因編碼產(chǎn)物的功能，為生產(chǎn)實踐中應(yīng)用提供了理論依據(jù)。烏伊罕［19］對DEV gE基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、抗原性及與其他皰疹病毒的同源性等做了詳盡的生物信息學(xué)分析，原核系統(tǒng)中表達的gE成熟蛋白（60 kDa）、gE成熟蛋白胞內(nèi)區(qū)（20 kDa）及胞外區(qū)（50 kDa）都可以與DEV陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pUC19-gE-EGFP，轉(zhuǎn)染DEF后可觀察到特異的綠色熒光，由此說明，EGFP基因有效的表達，為進一步研究基因缺失、重組病毒等方面奠定了基礎(chǔ)，為預(yù)防和研制鴨、鵝等水禽類疫病的基因工程疫苗提供技術(shù)平臺。常華［20］初步對鴨瘟病毒gE基因功能進行研究，結(jié)果顯示，該基因含有信號肽切割位點，編碼490個氨基酸的多肽，構(gòu)建原核載體pET32a/DPV-gE，重組蛋白大小約為74 kD，主要以包涵體的形式存在，采用間接免疫酶組化方法（IPA）檢測DPV gE蛋白感染鴨組織的分布規(guī)律，建立間接ELISA法并應(yīng)用其檢測重組蛋白pET32a/DPV gE鴨瘟病毒抗體，為后續(xù)研究DPV gE基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

2.3其他基因序列關(guān)于鴨腸炎病毒基因組結(jié)構(gòu)仍然沒有徹底研究清楚，導(dǎo)致與此相關(guān)的基礎(chǔ)研究無法深層次的展開，因此對這些未知序列進行測定具有重要意義。陳普成［21］克隆了鴨瘟病毒部分基因組序列，并構(gòu)建了重組病毒轉(zhuǎn)移載體，研究得到完整病毒基因組的DNA，大小位于145-194 kb之間；擴增獲得了鴨瘟病毒US1、US7、US8、UL41及UL42五個基因和部分末端反向重復(fù)序列；進化樹分析，結(jié)果表明，DEV UL41基因與а皰疹病毒亞科其他成員進化關(guān)系相對較遠，而US7、US8及UL42基因的進化樹表明DEV與火雞皰疹病毒、馬立克病毒的關(guān)系相近，為鴨瘟病毒的分類提供了參考依據(jù)。高亞東［22］研究DEV Clone-03的基因組未知序列，完成了DEV Clone-03基因組，DNAUS和UL區(qū)段共擴增出28 240 bp的核甘酸序列；同源性分析總體表明，DEV Clone-03與α皰疹病毒的同源性高于β皰疹病毒及γ皰疹病毒的同源性；構(gòu)建了的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明DEV Clone-03屬于α皰疹病毒亞科，就多數(shù)基因而言，DEV Clone-03和MDV更接近。

3結(jié)語

目前，關(guān)于鴨腸炎病毒基因研究取得了一定的成績，以分子生物學(xué)技術(shù)為主要手段，對DEV基因進行了生物信息學(xué)分析，從病毒遺傳演化、基因分子特征、編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能進行研究，探索了鴨腸炎病毒基因缺失構(gòu)建的方法，研發(fā)應(yīng)用于臨床檢測DEV的方法，為DEV的基因組結(jié)構(gòu)、歸屬和致病性的深入研究，為闡明DEV部分基因編碼蛋白在病毒感染、復(fù)制過程中的作用以及新型基因工程疫苗研制提供分子生物學(xué)依據(jù)。

但在UL區(qū)和US區(qū)的結(jié)合部以及兩側(cè)末端的重復(fù)序列仍然未知，基因組的結(jié)構(gòu)仍未徹底研究清楚，病毒基因的功能、病毒在機體細胞或者組織中的復(fù)制機理、病毒感染的過程、機體抗病毒感染機制等諸多方面研究有許多不明之處均有待進一步深入；但已克隆出的這些基因及其編碼產(chǎn)物具有何種生物學(xué)功能，它們對于病毒的復(fù)制、致病性及其產(chǎn)物鴨病毒性腸炎預(yù)防、控制作用需要更多更細致的研究；DVE的病原性在不斷變異，根據(jù)DVE病毒本身的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，如何應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基因疫苗也成為研究重點。

［1］Sandhu T S，Shawky S A.Duck virus enteritis（duck Plagure）.In：SaifY M，Varnes H J，Glisson J R，et al.11 th Eds Disease of Poultry［J］.Ames：lowa State University Press，2003，354-363.

［2］Hansen W R，Brown S E，Nashold S W，et al.Identifieation of duck Plague virus By Polymerase chain reaction［J］.Avian diseas，1999，43：106-115.

［3］Han X J，Wang J W.Cloning of thymidine kinase gene of duck Plague virus using degenerate PCR［J］.Agric Sci China，2005，4（8）：634-640.

［4］Han X，Wang J，Ma B.Cloning and Sequence of Glycoprotein H Gene of Duck Plague Virus Agric［J］.SciChina，2006，5（5）：397-402.

［5］Li H，Liu S，Kong X.Charaeterization of the genes encoding UL24，TK and gH Proteins from duck enteritis Virus（DEV）：a proof for the classifieation of DEV［J］.Virus Genes，2006，33（2）：221-227.

［6］陳希文.鴨腸炎病毒UL18基因部分特性及其原核表達蛋白應(yīng)用的研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［7］潘華奇.鴨腸炎病毒gB基因的克隆與表達及其產(chǎn)物的初步應(yīng)用［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［8］黃杰.鴨瘟病毒UL7基因的原核表達_多抗制備及其應(yīng)用［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［9］藺萌.鴨腸炎病毒gN基因及其功能的初步研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［10］姜龍.鴨瘟病毒UL49基因功能研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［11］劉峰源.鴨腸炎病毒糖蛋白gC基因的克隆_表達及部分功能的研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［12］孫昆峰.鴨瘟病毒gC基因疫苗在鴨體內(nèi)分布缺失株的構(gòu)建和生物學(xué)特性的初步研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［13］楊承槐.鴨腸炎病毒及其致弱毒株基因組的分子特征和生物學(xué)特性［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［14］石勇.鴨瘟病毒UL21基因的克隆表達與轉(zhuǎn)錄時相分析［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［15］婁昆鵬.鴨瘟病毒UL28基因的克隆_原核表達_細胞定位和轉(zhuǎn)錄時相研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［16］沈愛梅.鴨腸炎病毒UL45基因去跨膜區(qū)原_省略_制備_轉(zhuǎn)錄時相及編碼蛋白特性研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［17］范薇.鴨瘟病毒gD基因發(fā)現(xiàn)及重組蛋白應(yīng)用研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［18］信洪一.鴨瘟病毒US3基因的發(fā)現(xiàn)原核表達及應(yīng)用研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［19］烏伊罕.鴨腸炎病毒gE基因部分功能研究與轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［20］常華.鴨瘟病毒gE基因功能初步研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［21］陳普成.鴨瘟病毒部分基因組序列的克隆及重組病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

［22］高亞東.鴨腸炎病毒新基因的序列測定及其序列分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

S852.61+2

A

0529-6005（2016）08-0071-03

2016-02-26

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130522086JH）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20112223110002）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（201231）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（2015209）

杜翔宇（1989-），女，碩士生，從事分子病原微生物與分子免疫學(xué)研究，E-mail：dxy1209@163.com

董浩，E-mail：donghao_jlau@163.com