益生菌對環境的適應性研究進展

潘　娜，王　開，胡桂學

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

益生菌對環境的適應性研究進展

潘娜，王開，胡桂學

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

益生菌被定義為有益于消費者健康的活的微生物，分為乳桿菌類、雙歧桿菌類、革蘭陽性球菌3類。益生菌能夠調節緩解乳糖不耐受、腸道菌群平衡、改善腸道功能、促進機體對營養物質的吸收、降低血清膽固醇[1]及血壓、調節機體的免疫機能[2]、減少氧化應激等發揮益生作用[3-4]，與人類健康息息相關。被廣泛應用于發酵乳制品、肉制品、泡菜、飼料、護膚品等，其代謝產物細菌素也被用于食物的儲藏[5]。益生菌在食品發酵和消化道消化過程中，能在不理想的情況下生長和存活，引起了很多研究者對其應激反應機制的興趣。研究發現，益生菌為了適應環境的脅迫會進行應激改變，也有些研究者發現改變益生菌某些基因后，會對環境的適應性發生改變，而益生特性也會隨之發生改變。因此，本文就環境威脅時益生菌出現的改變及與環境適應性相關的基因做一綜述。

1　環境脅迫

1.1鹽脅迫細胞膜具有可滲透性，環境滲透壓的改變會影響細胞的生理功能，益生菌面臨滲透脅迫時膜蛋白可直接或間接調節細胞膜對鹽離子的滲透性，Na+/H+逆向轉運蛋白會外排Na+，阻止Na+的積累，減輕Na+對菌體細胞的毒害作用，同時通過增加對K+的吸收，恢復Na+/K+比，恢復細胞內離子和水濃度，以及吸收和合成相容性物質[6]。楊振泉研究發現，高濃度鹽（8%）能抑制益生菌的生長代謝，產酸減少，而高濃度鹽對鹽敏感性乳酸菌的抑制是發酵周期延長的主要原因，因此提高起始耐鹽性乳酸菌數量，可以加快高鹽泡菜成熟[7]。Fredericf研究發現，清酒乳桿菌CTC494在鹽脅迫條件下細菌素產量會下降，適量氯化鈉（2.3%～2.5%）能夠刺激LPC010產生細菌素[8]。烏日娜研究發現，在分子伴侶蛋白調控系統中，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp隨著NaCl濃度升高而上調，呈正相關[9]，其具體機制仍需進一步研究。

1.2膽鹽脅迫益生菌對膽鹽的耐受性能夠反應出其在腸道中的潛在的存活能力。1.0%～3.0%濃度膽鹽細菌素濃度較對照組高，抑菌效果最好。0.2%膽鹽處理90 min為干酪乳桿菌ATCC393膽鹽脅迫的亞適應條件。過高濃度膽鹽能使細胞破裂或凋亡，面對膽鹽脅迫時，益生菌能通過膽鹽水解酶、水解泵，產生應激蛋白抵抗膽鹽等多種有毒物質。Ana實驗研究發現，羅伊氏乳桿菌CRL1098在膽鹽脅迫時，25個蛋白位點發生差異表達，膽水解酶BSH基因明顯上調是細胞解毒的重要策略[10]。

1.3酸脅迫益生菌通過腸道時，胃酸是重要的脅迫因素之一。大量研究表明，乳酸菌在pH值5.0～6.5之間細菌素含量最高，pH值過高或過低均會影響益生菌產細菌素的效果[11]。pH值4.0處理90 min時干酪乳桿菌ATCC393處于酸脅迫的亞適應條件。細胞內部的酸化會減弱對酸敏感的酶活性，對蛋白、DNA造成損傷。酸脅迫時，酸應激誘導了許多伴侶蛋白和與脂肪酸合成的相關基因，抑制了關于類異戊二烯合成的甲羥戊酸途徑的基因，從而影響了細胞膜的流動性[12]。Renhui Huang等對有酸和無酸處理植物乳桿菌zdy2013也證實了酸處理組顯著提高了飽和脂肪酸和環丙烷脂肪酸的比例，不同程度的調控了一些與質子泵、氨基酸代謝、糖代謝、Ⅰ類和Ⅲ類應激反應途徑有關的基因。其中脂肪酸合成和堿生產中所涉及的基因表達明顯上調[13]。袁崢等也證實了這一點，隨著pH值的下降，嗜酸乳桿菌細胞膜質子泵相關酶H+-ATPase活性升高，同時菌體由纖細型變得粗壯，細胞膜單不飽和脂肪酸變多、碳鏈變長。精氨酸脫亞氨酸酶的酶活性增強，益生菌可能通過這些變化維持細胞正常的生理功能[14]。Wu C研究干酪乳桿菌時發現，天冬氨酸也參與了酸脅迫的耐受性，添加天冬氨酸提高了酸脅迫下干酪乳桿菌的生長性能和存活率[15]。

1.4溫度脅迫益生菌在30℃～37℃細菌素產生最高，低溫時益生菌生理狀態會發生改變，為了適應溫度脅迫，益生菌能夠誘導冷應激蛋白的合成來維持細胞膜的流動性，維持DNA螺旋及DNA合成效率。同樣熱脅迫也會對菌體存活造成不利影響，如使非共價鍵結合不牢，核糖體、RNA的不穩定以及膜流動性的改變。益生菌面對脅迫時，可產生熱應激蛋白，大部分熱應激蛋白屬于分子伴侶蛋白，能夠修復蛋白的生物學功能，增強益生菌對熱應激的耐受能力[16]。

1.5饑餓脅迫益生菌在營養缺乏的狀態下，體內的毒素-抗毒素系統會直接作用于DNA促旋酶和信使RNA，介導一種在不良生長環境下生長的自我調節機制，抑制基因表達，從而降低蛋白的合成速率，有利于自身節省能量和營養，在營養不良的環境中生存。

1.6氧脅迫非自由基類的氧衍生物統稱為活性氧族。活性氧族攻擊蛋白質、脂類和核酸等細胞物質，是造成細胞衰老和死亡的主要原因之一。在一些乳桿菌發現了催化分子氧形成H2O2和利用脂肪酸的去飽和化反應消耗分子氧清除分子氧[17]。Scott等在Lactococcus lactic氧脅迫中發現FlpA和FlpB蛋白能夠調控Zn（II）水平的升高，保護蛋白質己被氧化的自由疏基基團呈還原狀態，阻止二硫鍵的形成，從而避免易受活性氧族的攻擊[18]。左芳雷等研究發現，氧脅迫雙歧桿菌B.longum BBMN6時，B.longum BBMN6可以通過改變細胞表面結構以適應氧化脅迫，同時產生多磷酸鹽作為分子伴侶以保護蛋白質。促進活性氧的降解和維持氧化還原平衡、誘導一般脅迫反應、參與DNA和蛋白質修復、中心代謝途徑等生理過程的適應性調整[19]。

1.7乙醇脅迫朱敏研究發現，乙醇脅迫后面包乳桿菌D2-5、植物乳桿菌D5-5、干酪乳桿菌D5-8存活率顯著降低，使關鍵酶丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶和ATP酶失活、使細胞膜通透性增加、完整性被破壞[20]。Garbay S發現在葡萄酒的培養基中，酒酒球菌通過脂肪酸含量降低、膜蛋白升高提高了存活率[21]。隨著生物演化，酒酒球菌不斷調整膜組分耐受了各種脅迫，能夠進行蘋果酸-乳酸發酵（Malolactic Fementation，MLF），在增強抗逆性和供給能量方面發揮著重要作用，當pH值較低時，MLF能夠通過保持細胞內適合的pH值，維持酶的活性；MLF還可以通過物質的轉移，由pmf合成ATP，促進細胞的生長。H+-ATP酶也參與了耦合ATP的水解，將質子排出細胞，從而維持質子推動力和細胞內環境穩定，均在抗酸機制中發揮了重要作用[22]。

2　益生菌適應性基因

益生菌基因組的研究有助于揭示益生菌的遺傳和代謝機制，目前，微進化遺傳變異的機制包括二種：大量數據顯示，益生菌能夠通過基因水平轉移獲得一段遺傳物質以適應新環境[23]，在獲得新基因的同時，會將“無用”基因鈍化和消亡[24]；另一種是通過自身基因的變異。自2001年第一株乳酸菌全基因測序完成后，掀起了多個益生菌全基因測序的浪潮，許多研究者發現，改變某個基因后，會對益生菌的環境耐受性和益生菌特性發生改變。

2.1RR基因對內蒙古傳統發酵乳制品中分離的L.fermentum MG進行RR基因敲除后的突變體和L.fermentum MG野生型研究發現，突變體耐酸、耐膽鹽能力差，糞便中排出的L.fermentum MG活菌數量高，胃部和腸道部內容物和刮取物中的活菌數量低，對果糖和蔗糖的利用能力也顯著減弱。該試驗結果提示，RR基因在L.fermentum MG野生型中對胃腸道粘附作用、滲透壓的改變、酸性環境等外環境的變化、碳水化合物的代謝具有負調控作用[25]。

2.2CCPA基因分解代謝調控蛋白A（catabolite controlprotein A，CCPA）是一種多效調節蛋白，在乳酸乳球菌和植物乳桿菌中的有氧代謝調節中具有關鍵作用[26]。它能夠調節應激反應和有氧代謝，間接或直接調控許多涉及能量和氮代謝基因的轉錄。Li等研究發現，敲除CCPA基因后，代謝產物、酶活性、壓力耐受性、抑菌效果降低[27]。

2.3recA基因Duwat等發現recA基因突變的Lactococcus lactis較野生型菌株對分子氧更敏感。研究人員推測recA基因編碼的蛋白可能是通過直接修復損傷的DNA，來達到對抗氧脅迫的目的，也可能是在分子氧造成的DNA損傷修復中發揮間接的調控作用。試驗中同時發現，Lactococcus lactis突變株中分子伴侶蛋白的總水平降低[28]。

3　小結

益生菌在食品制造、加工和儲存過程中所遇到的壓力會降低它們的存活、穩定性和功能性，從而對功能性食品的性能有負面影響。了解威脅條件下益生菌細胞蛋白、水解泵、關鍵酶等應激改變以及益生菌環境適應性基因有利于進一步挖掘成熟菌株的應用潛力，同時也為篩選具有高脅迫抗性的優良菌株提供了可借鑒的思路。如何利用環境對益生菌的脅迫，仍需我們進一步了解微生物的細胞機制、潛在的耐受性、微生物細胞機制的耐受性以及如何改善壓力阻力等。

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S816.7文獻標志碼：B

0529-6005（2016）07-0121-03

2016-3-25

國家自然科學基金項目（31372413）

潘娜（1991-），女，碩士生，主要從事動物分子病原學研究，E-mail：751579895@qq.com

胡桂學，E-mail：guixue1964@126.com