我國鵝細小病毒免疫學研究進展

杜翔宇，李溫明，胡振林，張甜甜，胡桂學，董　浩

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局，遼寧 鐵嶺 112616；3.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

我國鵝細小病毒免疫學研究進展

杜翔宇1，李溫明2，胡振林1，張甜甜1，胡桂學3，董浩1

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局，遼寧 鐵嶺 112616；3.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）是小鵝瘟的病原體，GPV是一種單股的DNA病毒，從分類學角度講GPV屬于細小病毒科，細小病毒亞科。小鵝瘟是由GPV引起的一種高度接觸性急性或亞急性敗血性的傳染病，腸道栓塞為小鵝瘟特征性病變，通過排泄物和代謝分泌物排毒，傳播并且擴散到空氣環境中，飼料和水極其受到污染，經消化道引起本病迅速傳播，小鵝瘟具有較高的死亡率和較強的傳染性，7日齡以內的雛鵝非常容易受到感染。小鵝瘟每年在我國不同地區都有不同程度的發生，當在一個區域流行發生后，通常會間隔1-2年或者更長的時間再次發生，流行有一定周期性，疾病暴發后隱性感染的剩余鵝群得到了較強的免疫力，在后期的繁殖過程中將自身的抗體傳給雛鵝，從而使雛鵝存在自然被動免疫力。小鵝瘟給養鵝業造成了較大的經濟損失，因此受到科研工作者的廣泛重視。

目前關于GPV的免疫學方面的研究熱點主要包括活疫苗、滅活疫苗及基因工程疫苗的研制、研制與開發單克隆抗體以及抗原表位相關方面的研究。近些年分子生物學和細胞生物學的取得了快速進步，單克隆抗體技術也得到較好的發展，已經在遺傳學、免疫學、病毒學和分子生物學等領域受到廣泛應用[1-2]。弱毒疫苗株是目前較為常用的小鵝瘟疫苗，對成年鵝和雛鵝并不會產生致病性，但是其保護力較弱、毒力返強、外源病原難以控制以及生產成本高等缺點。基因疫苗為一類帶有外源抗原基因的真核重組質粒，在動物體內的宿主細胞中完成轉錄和翻譯過程后，能夠表達出相應的抗原蛋白，誘導出具有特異性的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫應答，從而達到預防和控制疾病的目的[3]。由于大部分天然抗原引發的免疫反應并不能夠實現預防感染或預防發病的目的，在表位水平上這就需要做出選擇從而改善蛋白質抗原的保護性，進而可以得到更理想的疫苗分子[4]。因此，鵝細小病毒免疫學是研究鵝細小病毒工作的重要組成部分，為更好的防范、控制小鵝瘟，切實為養殖企業帶來安全保障具有非常重要意義。

1　鵝細小病毒病原學特征

GPV呈現六角形或者圓形的外觀，不存在囊膜，同時也不帶有脂類以及糖類，直徑大約為20 nm～22 nm，在掃描電鏡下GPV以晶格排列，存在著完整的病毒粒子以及病毒空殼。GPV含有相等數目的正、負鏈DNA的病毒粒子，在提取核酸過程中，正、負極性鏈十分容易發生退火的現象形成互補的雙鏈DNA。GPV的基因組有LORF以及RORF兩個開放閱讀框架，2個開放閱讀框架之間存在一個18個堿基的片段，LORF編碼非結構蛋白（NS1、NS2），RORF編碼結構蛋白（VP1、VP2、VP3）。VP2、VP3結構蛋白是其主要免疫功能區，VP3結構蛋白是GPV的主要衣殼蛋白，VP3含有GPV主要抗原決定簇成分，因此VP3基因編碼的VP3蛋白在小鵝瘟免疫防治和診斷中起重要作用，是研究基因工程疫苗的首選蛋白[5]。

2　鵝細小病毒免疫學研究進展

2.1弱毒疫苗及基因疫苗的研究目前弱毒疫苗和滅活疫苗是主要用于小鵝瘟預防的疫苗，弱毒疫苗通過母源抗體使雛鵝獲得被動免疫的能力，可以誘導雛鵝產生持久的體液免疫，但是誘導雛鵝產生細胞免疫應答能力較弱。胡世君等用鴨胚尿囊液獲得的GPV病毒株，通過甲醛進行滅活，以此為抗原，加入礦物油佐劑，得到了油乳劑滅活苗，并且進行了實驗室檢測和臨床檢測，得到了很好的免疫保護效果[6]。潘玉民等利用白油作為佐劑，病原為當地分離到的小鵝瘟病毒，制備滅活疫苗，在臨床中應用于種鵝，在產蛋前20 d開始肌肉注射，每只1 mL，雛鵝的接種量為0.5 mL/只，接種該疫苗后，攻毒保護率為100%，因此證明該疫苗具有良好的保護效果和免疫原性[7]。陳伯倫等研究利用鴨胚進行弱化小鵝瘟病毒的毒力，而得到的弱毒疫苗，進行免疫種鵝，有95%的雛鵝具有抵抗小鵝瘟的能力，270～300 d內所產的蛋所孵出的雛鵝的免疫保護率為80%，結果說明母鵝所產出的雛鵝具有很好的免疫力[8]。

李琳選用自己分離的具有良好的免疫原性GPV JLDA株濃縮后，按照一定的配比加入白油、乳化劑等作為佐劑，成功地研制了鵝細小油乳劑滅活疫苗，GPV最小免疫劑量為0.25 mL/羽，在4℃的條件下油苗可以完好保存2年，室溫的條件下可以保存1個月的時間，物理性狀和免疫原性并沒有發生改變，符合油乳劑疫苗的標準，用4倍量進行免疫，試驗鵝無不良反應[9]。韓新峰將鵝白介素-2和VP3基因進行串聯融合表達，還嵌入了一段CpG免疫刺激序列，將獲得的3種基因疫苗免疫種鵝，母鵝所產蛋的卵黃抗體和中和抗體規律與所孵化的雛鵝攻毒保護效果呈現一定的正相關性，其中以pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫母鵝所孵出的后代雛鵝的攻毒保護率最高[3]。

2.2單克隆抗體的研制與開發具有高度敏感性以及特異性等的單克隆抗體，在動物疫病的診斷以及治療過程中有著不可替代的作用，在對GPV的相關研究中，我國許多科研工作者對抗小鵝瘟病毒的抗體進行了一定的探究。李新華以GPV強毒和弱毒為免疫原研制抗體，成功得到2株抗GPV弱毒的單抗和9株抗GPV強毒的單抗，同時還對抗小鵝瘟病毒中和性單克隆抗體進行了研制[10]；鄭義民以GPV強毒為免疫原制備了6株單抗，對GPV具有很好的特異性，不能與鴨肝炎病毒等反應[11]；李長瑜利用病毒抗原對6～8周齡小鼠進行4次免疫，然后采用免疫效價較高的小鼠脾細胞與SP/20骨髓瘤細胞進行融合，成功地篩選出來了8株能很好分泌抗GPV單抗，其陽性率大約為10.26%[12]。王娟將純化得到的GPV液作為制備單克隆抗體的免疫原，對6周齡雌性小鼠進行免疫試驗，成功得到3株能穩定分泌抗GPV的單抗的雜交瘤細胞株，實驗結果表明，此單克隆抗體能與GPV發生特異性反應，而與DHV、NDV、DPV并不會產生交叉反應[13]。

VP2和VP3是GPV的主要免疫功能區，與VP3存在相同的抗原決定簇，是制備基因工程疫苗的重要的基因。侯秋蓮對GPV中國分離株HG5/82毒株的VP2基因進行擴增、構建重組質粒、轉化后獲得融合蛋白，將純化的蛋白產物經3次肌肉注射新西蘭白兔，制備結構蛋白抗體，采用Western Blot方法對結構蛋白反應原性分析，試驗結果表明，所得融合蛋白擁有很好的反應原性[14]。杜秋明利用濃縮的GPV免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術，成功地獲得一株抗GPV單克隆抗體雜交瘤細胞株，試驗結果表明，雜交瘤細胞株能夠特異性的識別GPV尿囊毒和GPV-VP3蛋白，同時而與GST蛋白、GPMV、DHV、DPV無交叉反應，證明雜交瘤細胞株McAb有較好的特異性，雜交瘤細胞株McAb識別的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守區域，雜交瘤細胞株McAb能與GPV-VP3蛋白反應[15]。鹿鐘文利用GPV SYG61作為抗原3次免疫小鼠，再取其脾細胞與SP2/ 0細胞進行融合，成功地獲得了2株抗GPV的單克隆抗體，通過瓊脂擴散試驗進一步證明所得到的單抗腹水皆可以與小鵝瘟抗原產生明顯的沉淀線，同時都能夠與GPV VP3蛋白發生反應，產生特異性的亮綠色熒光[16]。

GPV非結構蛋白NS1是GPV的主要非結構蛋白，對GPV-NS1抗原表位進行研究，不僅有助于我們掌握其抗原結構的功能，在小鵝瘟早期的防治、診斷和病毒的抗原位點功能研究中具有重要的意義。仇錚利用重組質粒pcDNA3.1-GPV-NS1以及純化重組蛋白GPV-NS1為抗原，對4-6周齡的小鼠進行分組免疫試驗，然后將其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，間接免疫熒光試驗結果表明，其中的4株單克隆抗體能夠與pcDNA3.1-GPV-NS1產生強熒光的信號，表明單克隆抗體存在著特異性，同時Western Blot試驗結果表明，所獲得的單克隆抗體能夠與重組NS1非結構蛋白產生特異性反應[17]。

2.3抗原表位的研究研究GPV結構蛋白和非結構蛋白的抗原表位相關內容，一方面有利于發現其抗原結構與功能的關系，另一方面對GPV快速且準確的診斷以及研制并開發安全、高效的基因工程表位疫苗等具有十分重要的意義。李俚利用GPV-VP1重組融合蛋白與不同雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體進行免疫試驗反應，Western Blot試驗結果表明，單克隆抗體4B11、5G6、5C11的識別表位存在于GPV-VP1的92aa～123aa內；3A8識別的表位存在于111aa～136aa內；3G4識別的表位限定在111aa～145aa內[18]。郭鷺利用Ni-NTA親和層析純化后的GPV VP3重組蛋白作為免疫原，免疫電鏡和間接免疫熒光證明4株單抗能夠與GPV全病毒結合。通過Western Blot定位出兩個抗原表位為430aa～435aa和643aa～647aa[19]。王娟對抗GPV單克隆抗體的抗原表位進行了分析，根據GenBank發表的鵝細小病病毒株全基因序列，采用分段PCR方法對GPVVP3基因進行了擴增，然后成功獲得表達重組質粒；將篩選到的4個陽性重組質粒轉染COS-1細胞，用間接免疫熒光進行檢測顯示，在VP3基因的135aa～332aa和322aa～535aa處可以看到在COS-1細胞表而可見特異性熒光，試驗結果證實了單克隆抗體的特異性，確定在322aa～332aa處為3E8株單抗的抗原表位部分[2]。于天飛設計了覆蓋NS1蛋白C末端453aa～627aa的7個長約30個氨基酸殘基的重疊短肽，然后進行融合表達。結果表明，表達的融合蛋白NSb（485aa～514aa）、NSc（498aa～532aa）、NSd （523aa～556aa）、NSe（543aa～573aa）、NSf（564 aa～598aa）和NSg（599aa～627aa）能夠被GPV免疫的鵝血清識別[20]。仇錚結合單克隆抗體（MAb）技術對NS1抗原表位進行了鑒定，其中有3株MAb識別的抗原表位均位于485 aa～542 aa，表明485 aa～542 aa這一抗原表位區的抗原性最強[17]。黎明等采用生物學軟件對MDPV病毒蛋白的抗原表位進行了預測，并與GPV病毒蛋白抗原表位進行比對，結果表明，相同的表位優勢區域能夠產生交叉反應，可能存在交叉反應性的區段為321aa～325aa、426aa～430aa、540aa～544aa以及685aa～691aa[21]。李書光通過軟件優化分析預測GPV結構蛋白VP3段的抗原表位富集區，并設計引物，原核可溶性表達VP3的抗原表位富集區蛋白，免疫制備的抗血清中和效價能夠達到-2.608，以可溶性形式成功表達了GPV結構蛋白VP3優勢抗原表位區，且該蛋白作為免疫原具有很好的產生中和抗體的能力[5]。

3　展望

由于GPV本病傳播迅速、致死率高，開展GPV免疫相關方面的研究顯得尤為重要，常規疫苗對防制小鵝瘟起到了一定作用，但其自身存在不可避免的缺點，雖然如今開展了眾多關于GPV保護性基因的克隆和基因工程載體疫苗的構建，GPV核苷酸序列測定已為構建病毒載體和研制基因工程疫苗打下了堅實基礎，雖然大多局限于體外的研究，迄今為止GPV的疫苗研制、鑒別診斷、分子流行病學等，有待于進一步研究；研究以及制備抗GPV單克隆抗體，并對抗原表位進行研究，為建立以表位為基礎的抗原抗體診斷方法奠定一定基礎；由于GPV結構蛋白具有一定特殊性，鑒定的抗原表位可以同時作為VP1、VP2、VP3結構蛋白的共有表位，若為中和表位則可以能夠在重組診斷抗原和疫苗研制方面表現出更大的意義，這還需要付出更多的研究工作來進一步驗證。

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S852.65+9.5文獻標志碼：A

0529-6005（2016）07-0064-03

2015-12-07

吉林省科技發展計劃項目（20130522086JH）；高等學校博士學科點專項科研基金（20112223110002）；吉林省現代農業產業技術體系建設專項資金（201231）；吉林省教育廳科學技術研究項目（2015209）

杜翔宇（1989-），女，碩士生，從事分子病原微生物與分子免疫學研究，E-mail：dxy1209@163.com

董浩，E-mail：donghao_jlau@163.com