全基因組關(guān)聯(lián)分析及其在豬育種中的研究進(jìn)展

宋志芳，曹洪戰(zhàn)，2*，蘆春蓮，2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)豬業(yè)科學(xué)研究所，河北 保定 071000）

全基因組關(guān)聯(lián)分析及其在豬育種中的研究進(jìn)展

宋志芳1，曹洪戰(zhàn)1，2*，蘆春蓮1，2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)豬業(yè)科學(xué)研究所，河北 保定 071000）

近年來(lái)，隨著高通量單核苷酸芯片和基因分型技術(shù)的不斷發(fā)展，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析豬的性狀成為可能。全基因組關(guān)聯(lián)分析是一種新興的遺傳分析方法，能有效進(jìn)行復(fù)雜疾病和性狀的研究。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究人員針對(duì)豬性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，積累了大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記、候選基因以及數(shù)量性狀位點(diǎn)，為豬分子育種提供基礎(chǔ)。該文主要對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)分析的基本原理、分析方法以及對(duì)豬性狀的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

全基因組關(guān)聯(lián)分析；數(shù)量性狀位點(diǎn)；SNP標(biāo)記；多重檢驗(yàn)

我國(guó)是一個(gè)豬生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，國(guó)內(nèi)對(duì)豬肉的需求量巨大。最新數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)生豬出欄數(shù)為7.082 5億頭，豬肉產(chǎn)量5 487萬(wàn)t。預(yù)計(jì)2016年我國(guó)生豬出欄規(guī)模是6.15億頭，農(nóng)業(yè)部4月份公布了我國(guó)能繁母豬存欄數(shù)是3 771萬(wàn)頭。如此大規(guī)模的飼養(yǎng)和出欄規(guī)模，如果能夠很好地針對(duì)豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行遺傳改良，必然會(huì)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。然而，有些數(shù)量性狀如生長(zhǎng)性狀遺傳力低或難以準(zhǔn)確度量，利用傳統(tǒng)的育種方法耗時(shí)且進(jìn)展緩慢，準(zhǔn)確度不高。豬的60k高密SNP芯片已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用，能使基因組基因定位的精確度提高，并且對(duì)豬的體型外貌[1]、生長(zhǎng)[2-4]、肉質(zhì)[5-8]、繁殖[9-11]及行為[12]等多種性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），能夠進(jìn)一步深入了解性狀的遺傳基礎(chǔ)。目前全基因組關(guān)聯(lián)分析方法在豬性狀的研究方面已經(jīng)取得了一定的研究成果，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和大量數(shù)據(jù)，對(duì)豬育種工作奠定了基礎(chǔ)。

1 全基因組關(guān)聯(lián)分析的提出

關(guān) 聯(lián) 分 析 最 早 由N.Risch和Merikangas等人于1996年提出[13]，認(rèn)為關(guān)聯(lián)分析的檢測(cè)效率要明顯高于連鎖分析，且檢測(cè)力更強(qiáng)，并預(yù)測(cè)極有可能會(huì)應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析大規(guī)模檢測(cè)復(fù)雜疾病的遺傳機(jī)制。在GWAS發(fā)展的初級(jí)階段，關(guān)聯(lián)分析多數(shù)被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上復(fù)雜疾病的研究。而GWAS是研究復(fù)雜疾病遺傳變異的最行之有效的方法，對(duì)疾病的遺傳機(jī)制在基因水平上有更深入地了解。Klein R J等人于2005年在《Science》雜志上報(bào)道了第1例與年齡相關(guān)的黃斑變性全基因組關(guān)聯(lián)分析研究[14]，這是第一次利用GWAS發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病的分子標(biāo)記，之后更多的人應(yīng)用GWAS方法研究人類復(fù)雜疾病和動(dòng)植物復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)制，試圖探究遺傳機(jī)理為疾病的治療或性狀的改善提供科學(xué)的理論依據(jù)。利用GWAS方法在人類復(fù)雜疾病的遺傳研究方面日漸成熟，研究結(jié)果有助于人們逐漸了解人類復(fù)雜疾病和性狀的遺傳基礎(chǔ)，再進(jìn)一步深入研究所檢測(cè)到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和基因，以揭開(kāi)人類復(fù)雜疾病和性狀的遺傳奧秘。

2 全基因組關(guān)聯(lián)分析的基本原理

GWAS是指在人類全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），從中篩選出與人類疾病或動(dòng)植物復(fù)雜性狀相關(guān)的SNPs，可以利用其在全基因組水平上對(duì)疾病和復(fù)雜性狀的遺傳變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[15]。基本原理是：以連鎖不平衡（LD）為基礎(chǔ)，通過(guò)識(shí)別數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)個(gè)體的定位群體中高密度的分子標(biāo)記，一般是上萬(wàn)個(gè)甚至上百萬(wàn)個(gè)SNPs標(biāo)記，剔除無(wú)關(guān)SNPs，篩選出與復(fù)雜性狀表型變異相關(guān)的分子標(biāo)記，然后以SNP為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組水平上的相關(guān)分析，從而成為發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀基因變異的一種新方案。動(dòng)物復(fù)雜性狀GWAS分析原理是以SNP為輔助，進(jìn)行總體關(guān)聯(lián)分析，首先利用SNP芯片在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因分型，比較個(gè)體之間每個(gè)遺傳變異及其頻率的差異，然后統(tǒng)計(jì)分析全部變異與研究性狀之間的關(guān)聯(lián)性，最后對(duì)最相關(guān)的遺傳變異加以驗(yàn)證，并根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果確定其與研究性狀之間的關(guān)聯(lián)程度。

GWAS的一般流程大致為：確定研究群體和樣本數(shù)量（樣本數(shù)量越多，分析結(jié)果越可靠），提取樣本DNA，利用芯片進(jìn)行SNP分型，對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，采用合適的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型對(duì)相關(guān)性狀表型值和SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證等。

《Epidemiology》《Genetic》《Biometrics》等著名雜志從遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)角度對(duì)GWAS進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方向的探討和研究，期望低成本、高效地找到遺傳標(biāo)記與疾病之間的聯(lián)系，GWAS分析過(guò)程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問(wèn)題得到解決。在表型選擇時(shí)，要選擇遺傳度較高的疾病或者表型進(jìn)行檢測(cè)可提升遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究的把握度[16]，同時(shí)選擇表型的測(cè)定要盡量簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。

3 全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究方法

按照研究對(duì)象分類，可以分為基于無(wú)關(guān)個(gè)體的關(guān)聯(lián)分析和基于家系的關(guān)聯(lián)分析。基于無(wú)關(guān)個(gè)體的關(guān)聯(lián)分析主要采用病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，大多用來(lái)研究質(zhì)量性狀；基于隨機(jī)人群的關(guān)聯(lián)分析，主要用來(lái)研究數(shù)量性狀；在研究基于家系的樣本時(shí)，采用傳遞不平衡檢驗(yàn)（TDT）分析遺傳標(biāo)記與疾病數(shù)量表型和質(zhì)量表型的關(guān)聯(lián)可以排除人群混雜對(duì)于關(guān)聯(lián)分析的影響，但其在發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的檢驗(yàn)方面不如相同樣本量的病例對(duì)照研究有效。FBAT是運(yùn)用十分廣泛的基于家系的統(tǒng)計(jì)分析工具，能夠分析質(zhì)量性狀及數(shù)量性狀、調(diào)整混雜因素、分析基因-環(huán)境相互作用、分析單倍型、調(diào)整多重比較等。

按照研究階段分類，分為單個(gè)階段研究和兩個(gè)或多個(gè)階段研究。單個(gè)階段研究即在有足夠大量的病例和對(duì)照樣本數(shù)量后，統(tǒng)一對(duì)全部選中的SNP進(jìn)行基因分型，然后分析每個(gè)SNP與疾病的基本關(guān)聯(lián)，計(jì)算其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度和OR值（比值比）。然而，因需要大量的樣本數(shù)量，單個(gè)階段研究基因分型耗費(fèi)的資金巨大。兩個(gè)或多個(gè)階段研究即采用小樣本數(shù)量進(jìn)行第一階段的全基因組范圍內(nèi)的SNP基因分型，統(tǒng)計(jì)分析后篩選少量陽(yáng)性SNPs，在第二階段用更大數(shù)量的樣本對(duì)這些陽(yáng)性SNPs進(jìn)行基因分型，最后整合兩個(gè)階段的結(jié)果進(jìn)行分析。研究證明DNA pool和微陣列試劑盒都能減少基因分型的工作量，能夠進(jìn)行低成本、高效益的SNP篩選。以GWAS作為研究工具能夠鑒定出與性狀相關(guān)聯(lián)的基因區(qū)域和DNA標(biāo)記。利用其先初步定位候選QTL，再借助其他研究手段進(jìn)一步精確定位數(shù)量性狀核苷酸（QTN）位點(diǎn)。因?yàn)檫M(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析研究的根本目的是要尋找影響性狀表型的QTN，QTN是QTL內(nèi)對(duì)數(shù)量性狀變異真正發(fā)揮作用的核苷酸多態(tài)，能夠具體到DNA核苷酸水平，有助于深入地了解豬等動(dòng)物性狀的遺傳機(jī)制，揭示性狀差異的根本原因。

4 全基因組關(guān)聯(lián)分析在豬育種中的應(yīng)用情況

4.1 國(guó)外有關(guān)豬的GWAS研究現(xiàn)狀

2005年公布了家豬的基因組序列[17]，為以后的基因研究提供參考。2009年推出了豬的Illumina Porcine SNP60芯片，一經(jīng)推出國(guó)內(nèi)外科研人員利用豬的高密度芯片對(duì)豬重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了許多重要的SNPs、QTLs和候選基因，這些研究成果有助于未來(lái)豬分子育種的順利推進(jìn)。2012年《Nature》雜志報(bào)道了杜洛克豬的全基因組測(cè)序結(jié)果[18]，為其性狀的改善提供參考。Fa等[1]利用豬的IlluminaPorcineSNP60芯片對(duì)820頭商品母豬的體型構(gòu)造、背膘厚、肢體穩(wěn)固性狀進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)黑素皮質(zhì)素受體-4（MC4R）是影響背膘厚的候選基因，而IGF2是影響眼肌面積的重要候選基因，同時(shí)定位到了新的候選基因。Becker等[19]對(duì)192頭瑞典大白公豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析分析，在14號(hào)和2號(hào)染色體上分別鑒定出1個(gè)pH1和胴體長(zhǎng)的QTL。Wilson等[20]對(duì)豬的咬尾行為進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析分析，在有咬尾行為的豬上定位到2個(gè)顯著的SNP。W.Luo等[7]以大白×民豬雜交豬為試驗(yàn)群體對(duì)其肉質(zhì)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)45個(gè)顯著SNPs與肉質(zhì)性狀有關(guān)。L.Fontanesi等[21]對(duì)意大利大白豬的背膘厚進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出4個(gè)顯著SNPs與其背膘厚度有關(guān)。D.Becker等[22]對(duì)瑞士大白公豬進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)QTLs可能與豬的肉質(zhì)、外觀、繁殖力和生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)。

4.2 中國(guó)國(guó)內(nèi)有關(guān)豬的GWAS研究現(xiàn)狀

劉晨龍等人[23]對(duì)610頭杜長(zhǎng)大豬、336頭二花臉豬和333頭萊蕪豬3個(gè)群體25種血液性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析和Meta分析共得到610個(gè)顯著影響杜長(zhǎng)大豬、二花臉豬和萊蕪豬3個(gè)群體25種血液性狀的SNP位點(diǎn)，初步確定F13A1、SPTA1、DBNL、SLC25A28和CTSC基因分別是嗜堿性粒細(xì)胞百分比（BASR）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）和中性粒細(xì)胞百分比（NEUR）的重要位置候選基因，為分析豬種的血液性狀或免疫性疾病提供重要參考。張哲等人[24]對(duì)191頭杜洛克豬的全基因組高密度SNP基因型數(shù)據(jù)以及生長(zhǎng)性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在體重達(dá)100 kg日齡(D100)性狀上檢測(cè)到1個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP，在活體眼肌面積(LMA)性狀上檢測(cè)到6個(gè)染色體水平顯著關(guān)聯(lián)的SNP，都位于5號(hào)染色體上，分析表明BTG1和EFCAB6是影響生長(zhǎng)性狀的兩個(gè)候選基因。楊慧等人[25]對(duì)288頭白色杜洛克×二花臉F2群體母豬殺嬰行為性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)整個(gè)家系和60K SNP芯片信息推測(cè)出目標(biāo)個(gè)體的基因型，結(jié)果表明質(zhì)控后有效SNPs有34 591個(gè)，同時(shí)在8號(hào)染色體檢測(cè)到了49個(gè)與母豬殺嬰行為顯著相關(guān)的SNPs。劉欣[26]選擇大白豬×民豬F2資源群體為研究對(duì)象，對(duì)其胴體性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到頭重、蹄重、板油重、屠宰重、胴體長(zhǎng)以及背膘厚的顯著相關(guān)SNP位點(diǎn)數(shù)分別是63、84、56、8、78和35個(gè)。梁晶[27]通過(guò)GWAS在5號(hào)染色體上定位了與豬耳面積性狀顯著相關(guān)的區(qū)間，發(fā)現(xiàn)WIF1和LEMD3基因是影響豬耳性狀的有利候選基因。已經(jīng)利用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法研究了豬的多種性狀，如生長(zhǎng)性狀、胴體性狀、血液性狀、豬耳型性狀等，研究方法也日漸成熟，發(fā)現(xiàn)并定位了影響這些性狀的QTLs和SNPs，找到了與之相關(guān)的候選基因和主基因。

5 全基因組關(guān)聯(lián)分析存在的問(wèn)題

雖然GWAS在人類疾病和動(dòng)植物相關(guān)性狀的研究成果有很多，也得到了一些重要的理論成果，有益于疾病的治療和性狀的改良。具有精確性高、統(tǒng)計(jì)效率高、比較范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但是在應(yīng)用過(guò)程中也會(huì)不可避免地存在一些問(wèn)題：1）在大樣本研究中，人群混雜是導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的重要原因之一，數(shù)據(jù)結(jié)果存在誤差。利用統(tǒng)計(jì)分析手段控制人群混雜的影響、采用基于家系的研究等都能降低人群混雜對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響。為了降低假陽(yáng)性位點(diǎn)出現(xiàn)的概率，要對(duì)群體進(jìn)行分層，主成分分析法、基因組控制法和結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)法是處理群體分層的主要方法。2）使用GWAS時(shí)必須進(jìn)行多重檢驗(yàn)，提高結(jié)果的可信度。常用的方法有Bonferroni校正法、控制錯(cuò)誤發(fā)生率法和Permutation法。3）對(duì)基因-變異-環(huán)境之間的相互關(guān)系進(jìn)行解釋，需要更多與變異相關(guān)的微效基因。4）不能獲取功能基因的相關(guān)信息，只能得到基因與表型的統(tǒng)計(jì)信息，具體相關(guān)基因的功能還需要后續(xù)分析。

6 GWAS的展望和應(yīng)用前景

利用GWAS能夠幫助人們更多地了解人類和動(dòng)植物復(fù)雜疾病和性狀的遺傳基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)大量的SNP標(biāo)記，篩選出很多性狀的相關(guān)候選基因，在染色體上定位QTL。利用GWAS能找出全基因組范圍內(nèi)所有變異的等位基因頻率。另外，也能發(fā)現(xiàn)許多從未發(fā)現(xiàn)的基因及染色體區(qū)域，為研究復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制和相關(guān)性狀的遺傳改良提供更多的線索。大量有關(guān)人類和動(dòng)植物上應(yīng)用GWAS進(jìn)行相關(guān)研究的文章被發(fā)表，涉及成百上千種性狀和疾病。但是利用GWAS并不能找到真正的功能基因，清楚這些基因作用于性狀產(chǎn)生多大的影響，故弄清引起變異的根本原因存在一定的困難，還需要對(duì)發(fā)現(xiàn)的QTLs和分子標(biāo)記進(jìn)行更多地研究和分析。此外，利用其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，結(jié)果存在一定的誤差，故其應(yīng)用還存在局限性。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展和基因組研究的深入，相信在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)GWAS會(huì)得到越來(lái)越多的應(yīng)用，GWAS研究和計(jì)算方法也會(huì)得到不斷更新。

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2016-10-11）

宋志芳，E-mail:18730285576@163.com