高通量測序技術在骨質疏松研究中的應用

王 瀟 陳 健

(廈門大學醫學院，福建 廈門 361000)

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·綜 述·

高通量測序技術在骨質疏松研究中的應用

王 瀟 陳 健

(廈門大學醫學院，福建 廈門 361000)

高通量測序技術；精準醫療；骨質疏松

高通量測序(HTS)技術幾乎改變了生物醫學科學的每一個領域，近年來高通量測序技術發展飛快，將人們真正帶入了HTS的時代。新一代高通量測序技術具有測序通量高、測序時間短和測序成本低等特點。2015年初，美國總統奧巴馬宣布推出精準醫療計劃〔1〕。精準醫療是在分子生物學基礎上更精準、更個體化的醫療。HTS技術為精準醫療的實施提供了強大的技術支撐，為疾病的研究、預防、診斷及治療提供了更精準，更有效的手段。隨著老齡化社會的到來，骨質疏松(OP)已成為影響人們生活質量的一大疾病。60歲以上老年人，OP發病率男性為35.8%，女性為73%，接近40%的婦女一生中都會發生OP導致的骨折〔2〕。而OP的發生、發展是一個多基因控制的復雜過程。因此，HTS技術的發展能更加系統地闡述OP的發生、發展機制及為其診斷和治療提供強有力的工具。

1 HTS技術簡介

HTS技術也稱深度測序技術或下一代測序技術〔3，4〕。其在基因組測序、轉錄組測序、基因變達調控、轉錄因子結合位點的檢測以及甲基化等研究領域都有應用。最早被用于DNA測序的是產生于19世紀70年代中期的傳統的Sanger測序技術〔5〕，其測序耗時長，通量低，費用高，因此下一代測序技術應勢而生。目前所說的HTS技術主要是指2005年以來454 life sciences公司(現已被Roche公司收購)、ABI公司和Illumina 公司推出的第二代測序技術以及Helicos Heliscope和Pacific Biosciences推出的單分子測序技術〔6〕。此外，還有第三代的納米孔測序技術。這些技術的出現真正達到了一個基因組測序不超過2 000美元〔7〕。第二代測序技術有Roche/454公司的焦磷酸基因組測序技術，Polonator技術，Illumina 公司的Solexa技術，ABI公司的Solid技術等。這里介紹近年來應用較普遍的測序平臺。Illumina/Solexa公司2006年推出了AnalyzerⅡ〔7〕，隨后的幾年里不斷改進，提高了測序通量，降低了測序成本，占據了HTS的市場。該公司最近推出了一套測序時間和測序通量最優化的測序儀，包括Miseq、NexSeq500、Hiseq系列。其中Miseq和Hiseq是最成熟的測序平臺〔7〕。Miseq測序速度快，適合個人基因組測序、目標測序和小基因組測序。Hiseq2500測序通量高。其在2014年推出的HiseqX10〔7〕，運用圖案化流動槽技術，具有高通量、耗時短等特點。之后推出的NexSeq500〔7〕，采用一種新型雙通道測序方法，而Miseq和Hiseq都是四通道的測序方法。它的特點是核苷酸的檢測只需兩張圖片，減少了數據處理時間和提高了測序通量。但其誤差率與成熟的Hliseq平臺相似。2010年Life Technologies 公司推出PGM測序儀，其模版準備和測序步驟與Roche/454的焦磷酸測序技術類似〔7〕。在PGM基礎上，2012年又推出了Ion Proton測序儀，提高了測序通量。除此之外，Pacific Biosciences 公司推出的單分子實時測序技術(SMRT)，其特點是不需擴增過程，聚合過程是連續的，可以通過視頻上記錄的熒光信號實時讀取DNA序列。Dxford Nanopore technoloqies 公司在2014年推出了納米孔測序技術〔8〕，最早的設備是MinION，測序速度較快，讀長較長。如同所有的單分子測序技術，錯誤率很高，Jain等〔9〕最近報道其插入、刪除、替換率分別為4.9%，7.8%，5.1%。雖然其測序通量相對較低，精確度不高。但其在尺寸、測序速度、讀長、機器價格等方面的優勢，將使其在不久的未來有著更好的發展。HTS技術一直在不斷地完善，不斷的改進，并被廣泛應用于生物科學的各個方面。

2 HTS技術在OP研究中的應用現狀及存在問題

2.1 HTS技術在OP研究中的應用現狀 OP是最常見的代謝性骨病，作為最常見且治療費用最高的疾病之一，影響著全世界1/3的女性和1/5的男性〔10〕。其特點是具有低創傷性骨折的風險，將近1/2女性和1/4男性在60歲以上都會受OP性骨折的影響〔11〕。其中最嚴重的是髖部骨折，50%人骨折后不能恢復到骨折前的狀態，25%需長期家庭護理，還有25%在12個月之內死亡〔12〕。OP是一種多基因控制的家族性疾病。體內成骨細胞與破骨細胞在骨重塑過程中扮演著重要角色。成骨細胞來自造血干細胞，破骨細胞來自骨髓間充質干細胞，而骨細胞是從成骨細胞分化而來的。骨吸收與形成的不平衡導致了OP的形成。目前已知的WNT、NOTCH、Hedgehog、OPG-RANK-RANKL等信號通路可以調節成骨細胞和破骨細胞分化和形成。HTS技術可以檢測低頻率的與疾病相關的罕見的變異基因，而且已經成功地應用于描繪單基因疾病〔12〕。全基因組相關研究(GWAS)和全外顯子組測序(WES)可以幫助確定基因決定的單基因疾病和復雜疾病，包括OP和骨量紊亂等疾病。該方法已被用于發現導致OP的新基因〔10〕，可以提升對OP發病機制的理解和推動尋找新型靶向治療的發展。影響OP性骨折的因素很多，除了鈣缺乏、雌激素缺乏、年齡因素、以前是否有過骨折等，還有骨密度(BMD)。BMD具有高度遺傳性的特點，60%～90%的人骨密度變化是由基因決定的〔13〕。當然，除了BMD之外，其他與OP相關的特征也與遺傳因素相關。受研究技術的限制，傳統的疾病在基因方面的研究主要是以假說為導向的候選基因法。本世紀初，在描繪OP和大部分其他復雜疾病的基因上進展很小。但隨著全基因組相關研究的發展和下一代測序技術的出現，更多新的與BMD減少相關的基因位點被發現。近年來相關綜述表明發現有59個新的基因位點與BMD減少相關，而這些位點在以前的候選基因法中未被發現〔14〕。隨著科學技術的不斷發展，高通量基因分型技術的出現，將對OP及一些其他復雜疾病進行更進一步的分型，有利于提高對疾病的認識，對疾病的風險進行更好預測，尋找更精準的治療方法和減少治療過程中副作用的產生。HTS技術除了在基因組測序上的應用之外還在轉錄組測序、基因變達調控、轉錄因子結合位點的檢測以及甲基化等研究領域都有應用。骨髓間充質干細胞(MSC)的功能缺陷可能導致衰老過程和年齡相關性疾病，如OP等〔15〕。通過HTS對患有OP疾病的病人進行MSC的分析，可以提高對OP發生、發展機制的更進一步的新認識。此外，第二代HTS技術在表觀遺傳水平的研究上也發揮著巨大作用。骨重塑是成骨細胞與破骨細胞的共同作用而產生的，DNA的甲基化在成骨細胞和破骨細胞的分化中起著重要作用。堿性磷酸酶(ALP)是由成骨細胞分泌的具有催化骨礦化作用的一種酶。研究表明，DNA的甲基化可抑制ALP在骨細胞中的表達〔16〕。在成骨細胞轉移中，硬化蛋白編碼基因(SOST)啟動子區高甲基化可導致成骨細胞低表達〔17〕。此外，CPG島的低甲基化也參與了成骨細胞分化過程的調控〔18〕。組蛋白修飾及染色質重塑在成骨細胞分化過程中也發揮了不可忽視的調節作用。破骨細胞是體內唯一的骨吸收細胞，DNA甲基化依賴機制可以通過影響人骨組織中的RANKL和OPG的基因轉錄參與破骨細胞分化的調控〔16〕。此外，組蛋白乙酰化也參與了破骨細胞的活性調節。隨著HTS技術在RNA水平測序應用的發展，其在研究OP的發生、發展機制等方面也起著不可替代的作用。MSC在向成骨細胞分化的過程中，一些Micro RNA的表達水平變化會影響目的基因的轉錄，進而調控MSC的成骨分化過程〔19〕。一些體外實驗表明，Micro RNA在破骨細胞生成及骨吸收過程中也發揮了正性調控作用〔20〕。Li等〔21〕在J Cell Mol Med 上發表的綜述中提出以下假設：Micro RNA表達模式在物種進化中變異或者m RNA上Micro RNA結合位點的結構變異會有助于解釋進化過程中物種間的顱面變化、人類顱面疾病的發展和年齡增長引起OP形成中的生理變化。因此，HTS技術在RNA水平的應用可為進一步探索OP疾病提供強大的技術支撐。

2.2 HTS技術在研究OP疾病中存在的問題 近年來，雖然HTS技術在測序通量、測序耗時和測序成本上都有了很大進步，但也有著局限性。首先，其測序后的海量測序數據的后期處理和分析也是一大難題。其次，雖然其測序成本大大降低，但對于一個小型實驗室來說還是難以承受的。除此之外，與OP相關的單個基因具體功能尚未完全明了，限制了高通量測序在OP領域的跨越式發展研究。由于缺乏充足的動物實驗，基因治療在OP臨床應用的安全性尚未闡明。

3 HTS技術在OP研究中的應用展望

隨著人口老齡化的發展，老年人骨健康問題更為突出，患OP的患者越來越多，使其生活質量大大下降。HTS技術的出現，給OP等其他復雜疾病的研究提供了強大的技術支撐。隨著精準醫療計劃的提出，在醫療領域更加注重個性化。因此，對疾病的研究更大的挑戰。從疾病的預測到預防到診斷到治療護理及預后的評估等都做到個性化。從基因水平預測疾病的發生及疾病的易感性，然后做到更好地預防疾病發生。當疾病發生時應用更個體化的治療，精準治療可以大大減少治療過程中的副作用。在疾病的護理方面也做到個性化護理。此外，在疾病的預后評估時給出更精準的評估以便給予更精準的后期指導。將精準醫療的概念應用到OP，將給OP患者帶來福音。隨著科學技術的不斷發展和進步，HTS技術也在不斷地發展，且發展速度非常之快，朝著更大通量更快速度和更低成本的方向在不斷進步。此外，測序數據的分析技術也將不斷地進步，相信在不久的將來HTS技術在OP及其他復雜疾病的研究中將起更大的推動作用。為精準醫療在OP中的應用提供技術支撐。OP早期的癥狀和體征不明顯，缺乏特異性，故很難依據臨床診斷標準來做出早期診斷〔22〕。HTS技術的發展將為預測、預防OP的發生和OP的早期診斷提供技術支撐，將為OP患者提供更精準的治療，減少治療的副作用，提供更恰當的護理方法，給出更精準的生活指導，將大大推動生命科學的發展和醫療衛生事業的進步。

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〔2016-08-30修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學基金資助項目(No.81272168);福建省自然科學基金資助項目(No.2016J01623)

陳 健(1963-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事骨質疏松研究。

王 瀟(1991-)，女，在讀碩士，主要從事骨質疏松研究。

R681

A

1005-9202(2016)19-4915-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.116