p53在乳腺癌基因治療中的研究進展

詹　媛　江錦良　鄔黎青

(江西省腫瘤醫院病理科，江西　南昌　330029)

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p53在乳腺癌基因治療中的研究進展

詹媛江錦良1鄔黎青2

(江西省腫瘤醫院病理科，江西南昌330029)

p53基因；信號通路；細胞周期；乳腺癌；基因治療

全球每年有超過40萬的人死于乳腺癌。我國雖是低發地區，但乳腺癌患病率占所有腫瘤的7%～9%，患病人群也呈年輕化發展趨勢。研究發現50%的腫瘤存在p53突變，乳腺癌也存在p53異常，p53與腫瘤之間存在密切聯系。本文對p53在乳腺癌基因治療中的研究進展作一綜述。

1　p53結構及其特點

1979年Lane和Craword首次用免疫的方法發現猿猴空泡病毒(SV40)感染的NH3T3小鼠細胞核中存在一種物質，它是能與SV40大T抗原相互作用的核酸化核蛋白即p53蛋白，繼而發現了p53基因〔1〕。p53分為野生型和突變型兩類，前者在維持細胞正常生長，抑制細胞惡性增殖過程中起主要作用，使細胞分裂阻滯在DNA合成前期(G1)/DNA合成期(S)期，使細胞有足夠時間修復損傷，阻止細胞將損傷傳給子代。而mt-p53失去正常p53的抑癌作用，同時還因突變而具有癌基因的作用〔2〕。

野生p53(wt-p53)基因位于人染色體17p13.1區帶,含11個外顯子及10個內含子，第1個外顯子不參與編碼。p53上游400 bp處有啟動子p1,下游1 kb處有啟動子p2，二者為轉錄起始點，其啟動子不含CAAT盒、TATA盒、GC盒等常見啟動序列。p53 基因中有5個高度保守區,其中4個位于外顯子5～ 8。它們是突變熱點，分別編碼132～143、174～179、236～248 和272～281 號氨基酸。wt-p53基因轉錄為25 kb mRNA然后翻譯成393個氨基酸組成的分子量為53 kD的核磷酸化蛋白，其結構有：N-末端的轉錄激活結構域(1～42氨基酸)是高電荷區，含大量的酸性殘基，能與一系列蛋白結構(如p14ARF 和p300)結合，而調節轉錄功能。信號區(64～92個氨基酸)能誘導細胞凋亡，還有順序專一的DNA結合結構域(102～292氨基酸)，它能特異性地結合靶基因中的順勢作用元件,調節靶基因轉錄活性。具有的DNA四聚體化結構域(342～355個氨基酸)能抑制癌細胞增長。C-末端的非專一DNA結合區(370～393個氨基酸)則是與非特異性的DNA序列結合。p53的特殊結構決定了其重要分子生物學特性〔2～4〕。

2　p53基因在乳腺癌中的作用

國外研究報道〔4〕：15%～50%的乳腺癌存在p53缺失，相關研究對中國乳腺癌p53表達做了薈萃分析，結果表明乳腺癌中p53蛋白陽性表達率平均達45%〔5〕，說明p53異常與乳腺癌之間存在緊密聯系。作為多種細胞應激及細胞應答的中間環節，p53與基因網絡上、下游的各種基因及調控因子構成精細的信號通路，通過細胞凋亡及衰老等方式來維持DNA穩定。若p53發生突變會導致基因組不穩定、損傷的DNA不能修復，那么機體則易形成腫瘤。乳腺癌的發生與p53異常有關，正常乳腺細胞中wt-p53是通過以下途徑維持細胞基因組穩定。

p53-鼠雙微體蛋白(MDM2)負反饋環路調控是一系列復雜的調節。wt-p53的失活常常是因為MDM2調控的異常，后者是一種E3泛激素連接酶，它編碼一種鋅指蛋白P90能與p53結合，誘導p53的出核轉運、促進泛素化,最終p53被蛋白酶降解〔6〕。MDM2及MDMX(MDM4)具有同源性，MDM2能與p53直接發生作用，而后者雖不能直接作用于p53，但能夠增強MDM2活性，間接發揮作用〔6〕。當DNA損傷、離子輻射激活信號通路時，共濟失調毛細血管擴張綜合征突變基因(ATM)及ATM-RAD3相關基因(ATR)可被激活，進而導致p53及MDM2的磷酸化，使得p53與MDM2相互的結合能力下降，細胞核內p53水平升高。另一條反饋機制腫瘤抑制蛋白p14ARF-MDM2環路〔7〕，它可以抑制p53-MDM2信號途徑，升高p53水平。細胞周期相關轉錄因子(E2F)-1及Myc、Rasp14、Beta-catenin可增加ARF的轉錄及蛋白表達，從而使ARF與MDM2結合，抑制其E3泛素酶活性、增強p53功能。而p53又能下調ARF轉錄，形成精細的環路反饋。人體處于紫外線、離子輻射、化學誘變劑、致瘤病原體等復雜的外部環境暴露，導致乳腺細胞DNA發生損傷時，機體可以通過上述通路來維持細胞正常，增強p53抑癌功能，抑制腫瘤形成。倘若機體p53失活，那么乳腺細胞中損傷的DNA則會繼續傳給子代，最終形成乳腺腫瘤。

p53能激活下游靶基因GADD45、Bax、Puma、p21、Fas，發揮DNA修復、細胞周期阻滯〔8〕、抑制腫瘤血管等功能〔9〕。 GADD45是第一個被檢出的 p53下游靶基因，它有生長阻滯及DNA 損傷修復功能。p53為GADD45轉錄激活物，其編碼產物可以參與DNA 修復且抑制DNA 合成〔6〕。它可通過p53依賴及非依賴兩條途徑參與細胞周期監測點、細胞凋亡等重要細胞生命活動的調節，并通過抑制細胞生長及促進 DNA 損傷修復方式維持基因組穩定性，抑制細胞轉化和腫瘤的惡性進展〔10〕。p53還可以激活下游靶基因p21，p21作為細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)廣泛抑制劑，與細胞周期蛋白(Cyclin)A-CDK2、CyclinD1-CDK4、CyclinE-CDK2復合物結合，抑制其相應蛋白激酶活性，導致Rb不能磷酸化，轉錄因子E2F不能活化，最終引起G1/S期阻滯，使受損細胞有足夠時間修復損傷〔10，11〕。若DNA 的損傷發生在 S期之前，p21 蛋白主要通過與CDK/Cyclin 結合并抑制其功能使細胞周期停滯于 G1期。而發生在S期的損傷，主要是通過p21 與增殖細胞核抗原(PCNA)的相互作用來阻滯細胞周期。p21WAF1/CIP1基因在羧基末端編碼一個 PCNA 結合域，p21和PCNA結合可直接抑制DNA的合成。在正常細胞中P21與Cyclin、CDK、PCNA組成四聯體使增殖信號不能有效形成，其中包括E2F激活及DNA聚合酶形成，從而發生細胞周期阻滯〔10，12，13〕。

乳腺細胞損傷的DNA未被修復，p53則會啟動細胞程序性死亡過程即凋亡來阻止受損DNA遺傳給子代細胞。細胞凋亡是由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞主動死亡，其中涉及特殊基因激活及細胞發生特征的生化和形態學改變如凋亡小體的形成。目前已發現受p53基因調控與凋亡相關的基因有：Bak、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、DR5、Bax、Puma、Fas等〔12〕。Bax 是Bcl-2 家族中重要的促凋亡蛋白。Bcl-2基因是近年來新發現的原癌基因，腫瘤細胞凋亡受凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進基因 Bax 的雙向調節，而Bax也屬于Bcl-2家族。p53還可以與凋亡刺激蛋白(ASPP)形成復合物，ASPP1和ASPP2是同一蛋白質家族，他們可以促進 p53的細胞凋亡，增強p53與DNA 的結合，促進凋亡基因啟動子活化，增強p53的細胞凋亡功能，使細胞發生凋亡〔10，12，13〕。

乳腺癌的生長所需營養物質由血液供應，因此腫瘤需要大量的血管生長。血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的重要促進因子，是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂原，能促進內皮細胞分裂增殖及血管構建〔7〕。可使血管滲透性升高,血液大分子外滲沉積在血管外組織基質中，為腫瘤生長提供營養支持，同時血管通透性增加也促使腫瘤細胞的浸潤轉移。一旦停止血液供應，乳腺腫瘤組織就不能生長，甚至退化、壞死。wt-p53能抑制腫瘤血管生長，它通過抑制VEGF的表達，從而抑制血管的生成、降低血管通透性，最終抑制腫瘤惡化〔11〕。

3　p53基因治療乳腺癌

基因治療的成功取決于分子生物學發展水平及重組基因技術支持。Seki等〔11〕用基因治療的方法成功治愈腺苷脫胺酶(ADA)缺乏的患者。Serrano等〔10〕將bcl-2反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ODN)導入耐藥的骨髓瘤細胞內,加強化療藥物效果。

逆轉錄病毒導入是最早開展的基因導入法，由于它操作復雜、感染效率低，且存在重組入宿主基因組生成致病型重組病毒的危險，現已很少使用〔12〕。腺病毒導入法操作簡單、感染效率高，現已得到廣泛運用，并獲得較好的治療效果。腺病毒介導的p53感染腫瘤細胞后能有效地控制腫瘤細胞生長或引起凋亡〔11〕。中國在2003年首次批準基因治療藥物——p53重組腺病毒藥物Gendicine的運用〔11〕。目前它已經用于腫瘤臨床治療乳腺癌、膀胱癌治療。雖然腺病毒治療法療效顯著，但也存在一些問題如毒副反應、感染等。目前國內外學者仍在不斷研究新的基因治療方法。基因封閉是基因治療的新技術，它是運用各種類型的反義分子在基因水平有選擇地去封閉有害基因的表達,從而達到治療疾病的作用，包括RNA干擾(RNAi)〔13〕、ODN、反義RNA、核酶〔14〕等。te Poele等〔12〕體外合成能與p53特異性結合的小干擾RNA(siRNA),用其轉染乳腺細胞系MDAH087以治療腫瘤。Mottolese等〔13〕發現核酶可以令p53下游基因 p21和 Bax的表達激活，促進腫瘤細胞凋亡。這些案例為基因治療可行性提供有力的說明。研究發現一些作用于p53-MDM2通路的小分子抑制劑如Nutlin-3a、MI-219，能與p53競爭性結合MDM2，從而抑制腫瘤〔15〕。如今p53疫苗研究也進入了實驗研究階段，p53作為外來抗原使機體發揮體液免疫，產生p53抗體，同時激活CD4+、CD8+T細胞，通過細胞免疫來抗腫瘤〔16，17〕。綜上，p53突變分析及其信號通路研究為腫瘤治療提供新的思路。目前針對p53的抗腫瘤藥物已經上市、關于基因治療腫瘤的研究也在不斷深入。

1Lvkovic-Kapicl T,Knezevic-Usaj S,Panjkovic M,etal.The influence of aging on pathologic and immunobiologic parameters of invasive ductal breast carcinoma〔J〕.Vojnosanit Pregl,2006;63(11):921-7.

2Li Y,Bhuiyan M,Vaitkevicius VK,etal.Structural alteration of p53 protein correlated to survival in patients with pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Pancreas,1999;18(1):104-10.

3Tiguert R,Bianco FJ,Oskanian P,etal.Structural alteration of p53 protein in patients with muscle invasive bladdert ransitional cell carcinoma〔J〕.J Urol,2001;166(6):2155-60.

4Vogelatein B,Lane D,Levine AJ.Surfing the p53 network〔J〕.Nature,2000;408(6810):307-10.

5Harris SL，Levine AJ．The p53 pathway:positive and negative feedback loops〔J〕.Oncogene，2005;24(17)：2899-908.

6Gartel AL，Radhakrishnan SK． Lost in transcription:p21 repression，mechanism，and consequences 〔J〕.Cancer Res，2005;65(10):3980-5．

7Thompson JS,Ling X,Grunstein M.Histone H3 aminoterminus is required for telomeric and silent mating locus repression in yeast〔J〕.Nature,1994;369(6477):245-7.

8Jussila L,Alitalo K.Vascular growth factors and lymphangioegenesis〔J〕.Physiol Rev,2002;82(3):673-700.

9Kimura SH,Ikawa M,Ito A,etal.Cyclin G is involved in G2/M arrest in response to DNA damage and in growth control after damage recovery〔J〕.Oncogene,2001;20(25):3290-300.

10Serrano M,Lin AW,McCurrach ME,etal.Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a〔J〕.Cell,1997;88(5):593-602.

11Seki M,Iwakawa J,Cheng H,etal.P53 and PTEN/MMAC1/TEP1 gene therapy of human prostate PC-3 carcinoma xenografi,using transfemin-facilitated lipofection gene delivery strategy〔J〕.Hum Gene Ther,2002;13(6):761-73.

12te Poele RH,Okorokov AL,Jardine L,etal.DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Res,2002;62(6):1876-83.

13Mottolese M,Dadasi EA,Botti C,etal.Phenotypic changes of p53 Her2,and Fas system in multiple normal tissues surrounding breast cancer〔J〕.Cell Physiol,2005;204(1):106-12.

14Hofland HE,Masson C,Iginla S,etal.Folate-targeted gene transfer in vivo〔J〕.Mol Ther,2002;5(6):739-44.

15Liu Q,Gazitt Y.Potentiation of dexamethasone,paclitaxel,and Ad-p53-induced apoptosis by Bcl antisense oligodeoxynucleotides indrug resistant multiple myeloma cells〔J〕.Blood,2003;101(10):4105-14.

16Yu W,Pirollo KF,Rait A,etal.A sterically stabilized immuno lipoplex for systemic adm in is tration of a therapeutic gene〔J〕.Gene Ther,2004;11(19):1434-40.

17Sanding BV,Brand K,Herwig S,etal.p16 and p53 genes transferred with the help of adenovirus to induce apoptic tumor cell death〔J〕.Ugeskr Laeger,1997;159(46):6825-30.

〔2015-04-09修回〕

(編輯苑云杰/王一涵)

鄔黎青(1963-)，女，博士，碩士生導師，主任醫師，主要從事乳腺癌研究。

詹媛(1990-)，女，碩士，住院醫師，主要從事乳腺癌研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)17-4391-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.125

1南昌大學第一附屬醫院2南昌大學第二附屬醫院