基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在臨床微生物檢驗的應用進展

李　欣　高海軍　張　勤　許建成

(吉林大學第一醫院檢驗科，吉林　長春　130021)

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基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在臨床微生物檢驗的應用進展

李欣高海軍1張勤許建成

(吉林大學第一醫院檢驗科，吉林長春130021)

〔關鍵詞〕基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；微生物；鑒定

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)是一種新型的質譜技術，具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快的特點。目前，MALDI-TOF已開始應用于多項微生物的檢測，為臨床疾病的診療提供有效的指導。

1MALDI-TOF鑒定微生物的特點及優勢

MALDI-TOF系統由基質輔助激光解吸電離離子源(MALDI)、飛行時間質量分析器(TOF)和檢測器組成，屬于一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定〔1〕。其原理是利用激光照射待測物與基質形成的共結晶薄膜，通過基質吸收能量并將能量轉移至待測物分子，使分子解離成離子，利用離子在電場中運動的性質，按離子質菏比(m/z)的大小順序進行收集和記錄，得到質譜圖,與數據庫中各種已知微生物的標準圖譜進行比對，從而完成對微生物的鑒定。

而直至目前，臨床實驗室仍然非常依賴傳統的微生物鑒定方法，耗時長、靈敏度低，遠不能滿足臨床感染性疾病病原體快速診斷的需要。在此基礎上，16S rRNA測序、PCR因其快速，精確的優勢，對微生物的鑒定起到重要作用，但其操作復雜，價格昂貴〔2,3〕,仍不能滿足一般臨床微生物鑒定的需求。MALDI-TOF這種技術樣品預處理簡單，無需對樣品預評估，樣本的預處理僅需3步(挑選菌落、點樣、加入基質)，3 min內即可完成全部的預處理，所需耗材如乙醇、乙腈、甲酸等為常用試劑，成本低廉。其鑒定結果采用得分形式，具有清晰、準確性〔4〕,國內有研究顯示鑒定準確率可達到95%以上〔5〕,另有國外學者Nomura〔6〕高度評價其為微生物領域具有革命性的轉折。

2MALDI-TOF在微生物領域鑒定的應用

2.1細菌最新研究顯示，MALDI-TOF在細菌的鑒定中取得了顯著的成效，研究通過將MALDI-TOF與傳統全自動微生物鑒定/藥敏分析系統 (VITEK 2)比較，不符合的標本再與“金標準”16s rRNA測序方法比較，發現臨床常見細菌如葡萄球菌(99.7%)〔5〕、腸桿菌(96.7%)〔7〕、非發酵革蘭陰性桿菌(98.75%)〔8〕等的鑒定準確率令人可觀。

2.1.1革蘭陰性菌2013年Richter等〔7〕研究顯示該技術對于絕大多數腸桿菌可鑒定到種水平，但大腸埃希菌和志賀菌仍不能嚴格區分，需要附加試驗加以佐證。MALDI-TOF可準確鑒定鮑曼不動桿菌〔9〕。對于變形桿菌只能鑒定到屬水平，無法區分普通變形桿菌與奇異變形桿菌〔5〕。依據目前的數據庫，弧菌屬(97%)〔10〕、加德納菌屬(97.4%)〔11〕、枸櫞酸桿菌屬〔7〕、伯克霍爾德菌(100%)〔12〕等鑒定結果準確可靠，已經被用于臨床感染性疾病病原體的鑒定。

2.1.2革蘭陽性菌目前已有多項研究表明葡萄球菌、腸球菌菌種水平的鑒定準確率近乎100%〔5,7〕，但是，該技術在鏈球菌的鑒別存在缺陷，對肺炎鏈球菌與緩癥鏈球菌尚難以區分，需要進一步試驗鑒定。其他陽性菌如棒狀桿菌屬〔13〕、李斯特菌〔14〕、乳酸球菌〔15〕等的鑒定結果準確可靠。

2.1.3厭氧菌近年來，厭氧菌的鑒定在內源性感染性疾病中受到了廣泛的關注。隨著MALDI-TOF進入微生物實驗室在厭氧菌鑒定研究的不斷深入，2014年在一項對106份厭氧菌的研究中，MALIDI-TOF與傳統技術的鑒定結果一致率可達95.3%〔16〕，另有大量關于其在厭氧菌鑒定方面的應用〔17～19〕,旨在通過低分子量的蛋白質譜，對消化鏈球菌屬、普雷沃菌屬、脆弱類桿菌、丙酸桿菌屬、乳桿菌屬、破傷風梭狀芽孢桿菌屬的鑒定及臨床感染性疾病的診治提供更有價值的信息。

2.1.4分枝桿菌MALDI-TOF在鑒定分枝桿菌時，需通過特殊的蛋白提取步驟，更為有效的蛋白萃取方法，進而建立分枝桿菌蛋白標記物的數據庫，對大多數分枝桿菌的鑒定起到關鍵作用。2015年Tudo等〔20〕研究顯示，在結核桿菌方面，該技術仍不能鑒定到菌種水平，除一些親緣關系密切的菌種，如鳥分枝桿菌與胞內分枝桿菌，偶發分枝桿菌與膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌、胞內分枝桿菌之間難以鑒別，大多數分枝桿菌都能用MALDI-TOF技術鑒別。

2.2真菌在真菌鑒定方面，MALDI-TOF不僅優于傳統生化鑒定程序，而且可以區分親緣關系密切的菌屬〔21〕，如白色念珠菌與都柏林念珠菌、近平滑念珠菌(1型、2型、3型)、光滑念珠菌與布拉加念珠菌等。已建立的龐大數據庫為MALDI-TOF絲狀真菌的鑒定提供了基礎，Becker等〔22〕研究顯示MALDI-TOF在絲狀真菌菌種水平鑒定的精確率達95.4%。此外，De Respinis等〔23〕拓展了皮膚絲狀真菌的數據庫，其中包含13種菌屬與131種菌，在8種菌屬鑒定的準確率可達到100%。

2.3病毒在感染性疾病中，病毒因其嚴格細胞內寄生，分離培養較困難，需時很長，且有些病毒至今仍不能培養，需采取快速診斷的方法得以鑒定，而MALDI-TOF憑借其高通量、周期短的優勢逐漸在臨床病毒學領域扮演重要角色。Calderaro等〔24〕通過檢測脊髓灰質炎病毒特異蛋白(VP)從而鑒定感染細胞和非感染細胞,并且聯合應用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)純化蛋白質以提高對脊髓灰質炎病毒檢測的敏感性和特異性，節省了核酸分析的時間，為疾病的治療爭分奪秒。此外MALDI-TOF在病毒檢測方面不僅與傳統技術具有較高的一致性〔25〕，同時在大規模流行病學研究方面具有較大的潛能〔25〕。

2.4耐藥菌株除鑒定正常的微生物菌群外，MALDI-TOF也被用于耐藥菌株的鑒定。Du等〔26〕早期研究發現MALDI-TOF可以將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)與甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)區分開來。Luo等〔5〕、Kempf等〔27〕研究證實MALDI-TOF在檢測產碳青霉烯酶尤其是內酰胺酶方面具有特異度高、準確度高的優勢。Li等〔28〕通過檢測頭孢噻肟與69株G-菌孵育后水解產物的量，表明MALDI-TOF在檢測超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的G-菌中具有潛在的臨床價值，今后可在臨床微生物實驗室廣泛開展。2014年Lange 等〔29〕通過采用MALDI-TOF成功鑒定耐美羅培南的肺炎克雷伯桿菌，準確度達97.3%，特異度達93.5%。然而，因腸球菌(如糞腸球菌和屎腸球菌)，腸桿菌(如大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌)這些菌株所得的耐藥菌株與正常菌株的質譜圖沒有明顯差異，所以該技術尚不能對該菌株耐藥性做出準確的鑒定。

3MALDI-TOF的局限性

首先，MALDI-TOF數據庫仍需不斷完善，對于一些稀有菌種和親緣關系緊密的菌株(大腸埃希菌與志賀菌)的鑒定容易造成誤差〔7〕。同時，MALDI-TOF目前尚不能為某個特定菌種設定一個具體分離該菌的閾值；當樣品含多個菌種時，MALDI-TOF只能區分到亞種水平，且當某一菌種數量占據絕對主導地位時，MALDI-TOF分離和鑒定會受到明顯限制。再者，MALDI-TOF鑒定血培養陽性菌屬時，血液中的血紅蛋白、白蛋白會干擾質譜信息，因此必須提前對樣本進行額外的凈化處理〔18〕。另外，MALDI-TOF雖然可以成功鑒定產碳青霉烯酶耐藥菌株，但對于其他細菌及真菌耐藥機制的研究尚不明確。此外，靶板點樣，涂布均一性，菌株本身生長速度，這些因素都會影響檢測的敏感性、可靠性，值得我們進一步研究。從理論上講，MALDI-TOF可以直接鑒定血液、尿液、腦脊液等體液中的病原微生物，但實踐中發現這些體液中可能含有非蛋白物質，會對蛋白質譜信息產生一定的干擾。因此，通過優化樣本提取或萃取步驟，MALDI-TOF有望成為更為高效的微生物鑒定方法。

4展望

MALDI-TOF是一項快速、簡潔、準確鑒定病原微生物的新型技術，如能將MALDI-TOF用于鑒定微生物毒素蛋白，我們就可以借此了解微生物的致病因素，對于新型爆發菌株的致病性研究具有很大的意義。隨著質譜數據庫及操作規程不斷完善和規范化，MALDI-TOF的方法必將成為臨床微生物鑒定的重要工具，為臨床感染性疾病的診治提供巨大幫助。

5參考文獻

1Emonet S,Shah HN,Cherkaoui A,etal.Application and use of various mass spectrometry methods in clinical microbiology〔J〕.Clin Microbiol Infect,2010;16(11):1604-13.

2Avni T,Mansur N,Leibovici L,etal.PCR using blood for diagnosis of invasive pneumococcal disease:systematic review and meta-analysis〔J〕.J Clin Microbiol,2010;48(2):489-96.

3Rampini SK,Bloemberg GV,Keller PM,etal.Broad-range 16S rRNA gene polymerase chain reaction for diagnosis of culture-negative bacterial infections〔J〕.Clin Infect Dis,2011;53(12):1245-51.

4Eigner U,Holfelder M,Oberdorfer K,etal.Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory〔J〕.Clin Lab,2009;55(7-8):289-96.

5Luo Y,Siu GK,Yeung AS,etal.Performance of the VITEK MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid bacterial identification in two diagnostic centres in China〔J〕.J Med Microbiol,2015;64(Pt 1):18-24.

6Nomura F.Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS):A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology〔J〕.Biochem Biophys Acta,2015;1854(6):528-37.

7Richter SS,Sercia L,Branda JA,etal.Identification of Enterobacteriaceae by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using the VITEK MS system〔J〕.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2013;32(12):1571-8.

8Mellmann A,Bimet F,Bizet C,etal.High interlaboratory reproducibility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based species identification of nonfermenting bacteria〔J〕.J Clin Microbiol,2009;47(11):3732-4.

9Mencacci A,Monari C,Leli C,etal.Typing of nosocomial outbreaks of Acinetobacterbaumannii by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry〔J〕.J Clin Microbiol,2013;51(2):603-6.

10Erler R,Wichels A,Heinemeyer EA,etal.VibrioBase:A MALDI-TOF MS database for fast identification of Vibrio spp.that are potentially pathogenic in humans〔J〕.Syst Appl Microbiol,2015;38(1):16-25.

11Benagli C,Rossi V,Dolina M,etal.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of clinically relevant bacteria〔J〕.PLoS One,2011;6(1):e16424.

12Fehlberg LC,Andrade LH,Assis DM,etal.Performance of MALDI-ToF MS for species identification of Burkholderiacepacia complex clinical isolates〔J〕.Diagn Microbiol Infect Dis,2013;77(2):126-8.

13Alatoom AA,Cazanave CJ,Cunningham SA,etal.Identification of non-diphtheriaecorynebacterium by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry〔J〕.J Clin Microbiol,2012;50(1):160-3.

14Barbuddhe SB,Maier T,Schwarz G,etal.Rapid identification and typing of listeria species by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry〔J〕.Appl Environ Microbiol,2008;74(17):5402-7.

15Rychert J,Burnham CA,Bythrow M,etal.Multicenter evaluation of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for identification of Gram-positive aerobic bacteria〔J〕.J Clin Microbiol,2013;51(7):2225-31.

16Zarate MS,Romano V,Nievas J,etal.Utility of MALDI-TOF MS for the identification of anaerobic bacteria〔J〕.Rev Argent Microbiol,2014;46(2):98-102.

17Chean R,Kotsanas D,Francis MJ,etal.Comparing the identification of clostridium spp.by two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF)mass spectrometry platforms to 16S rRNA PCR sequencing as a reference standard:A detailed analysis of age of culture and sample preparation〔J〕.Anaerobe,2014;30:85-9.

18Barba MJ,Fernandez A,Oviano M,etal.Evaluation of MALDI-TOF mass spectrometry for identification of anaerobic bacteria〔J〕.Anaerobe,2014;30:126-8.

19Nagy E,Becker S,Kostrzewa M,etal.The value of MALDI-TOF MS for the identification of clinically relevant anaerobic bacteria in routine laboratories〔J〕.J Med Microbiol,2012;61(Pt 10):1393-400.

20Tudo G,Monte MR,Vergara A,etal.Implementation of MALDI-TOF MS technology for the identification of clinical isolates of Mycobacterium spp.in mycobacterial diagnosis〔J〕.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2015;34(8):1527-32.

21Lima-Neto R,Santos C,Lima N,etal.Application of MALDI-TOF MS for requalification of a Candida clinical isolates culture collection〔J〕.Braz J Microbiol,2014;45(2):515-22.

22Becker PT,de Bel A,Martiny D,etal.Identification of filamentous fungi isolates by MALDI-TOF mass spectrometry:clinical evaluation of an extended reference spectra library〔J〕.Med Mycol,2014;52(8):826-34.

23De Respinis S,Monnin V,Girard V,etal.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight(MALDI-TOF)mass spectrometry using the Vitek MS system for rapid and accurate identification of dermatophytes on solid cultures〔J〕.J Clin Microbiol,2014;52(12):4286-92.

24Calderaro A,Arcangeletti MC,Rodighiero I,etal.Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)mass spectrometry applied to virus identification〔J〕.Sci Rep,2014;4:6803.

25Kim YJ,Kim SO,Chung HJ,etal.Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments〔J〕.Clin Chem,2005;51(7):1123-31.

26Du Z,Yang R,Guo Z,etal.Identification of Staphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry〔J〕.Anal Chem,2002;74(21):5487-91.

27Kempf M,Bakour S,Flaudrops C,etal.Rapid detection of carbapenem resistance in Acinetobacterbaumannii using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry〔J〕.PLoS One,2012;7(2):e31676.

28Li B,Guo T,Qu F,etal.Matrix-assisted laser desorption ionization:time of flight mass spectrometry-identified models for detection of ESBL-producing bacterial strains〔J〕.Med Sci Monit Basic Res,2014;20:176-83.

29Lange C,Schubert S,Jung J,etal.Quantitative matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid resistance detection〔J〕.J Clin Microbiol,2014;52(12):4155-62.

〔2015-12-20修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：許建成(1976-)，男，副教授，副主任醫師，主要從事細菌耐藥機制的研究。

〔中圖分類號〕R37

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3336-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.118

1吉林大學第一醫院神經腫瘤外科

第一作者：李欣(1990-)，女，碩士在讀，主要從事臨床微生物學研究。