克方的急性毒性和長期毒性實驗研究Δ

張光際，楊 凡，時 樂，尹 蓮，徐 立（南京中醫藥大學藥學院，南京 210023）

克方的急性毒性和長期毒性實驗研究Δ

張光際＊，楊 凡，時 樂，尹 蓮，徐 立（#南京中醫藥大學藥學院，南京 210023）

目的：考察克方的急性毒性和長期毒性，為其臨床試驗與合理用藥提供參考。方法：將20只ICR小鼠隨機分為克方組（350 g/kg）和正常對照組（飲用水），每組10只，每天ig給藥2次（間隔8 h），連續14 d，進行急性毒性實驗。將120只SD大鼠隨機分為正常對照組（飲用水）和克方高、中、低劑量組[5、2.5、1.25 g（生藥）/ml]，每組30只（♀♂各半），每天ig給藥2次（間隔8 h），連續12周，進行長期毒性實驗。結果：克方最大耐受量為350 g/kg，相當于臨床人用量的140倍。與正常對照組比較，克方高劑量組大鼠體質量增長緩慢、攝食量減少（P＜0.05或P＜0.01）；雄性大鼠血中紅細胞分布寬度、血紅蛋白含量分布寬度、平均血紅蛋白濃度降低，血小板平均體積、網織紅細胞升高（P＜0.05或P＜0.01），但均在本實驗室正常生理值范圍內；克方高劑量組大鼠血中尿素氮、總膽紅素、天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶活性升高（P＜0.05或P＜0.01），恢復期大鼠未見異常；給藥12周后，克方中、低劑量組大鼠凝血酶原時間縮短（P＜0.05或P＜0.01）；克方高劑量組發現8只大鼠膀胱黏膜上皮細胞輕、中度變性和壞死、脫落，恢復期無異常。結論：克方在臨床140倍用量下對小鼠未見明顯毒性作用?？朔竭B續重復給藥12周后，對大鼠肝臟、腎臟代謝有影響；具有一定的可逆性膀胱毒性；恢復期大鼠各項檢查未見病變加深或遲發性病變。

克方；急性毒性；長期毒性；大鼠；小鼠

國醫大師周仲瑛教授根據多年的臨床觀察與治療經驗，總結出肺癌的關鍵癌毒因素在于痰濁、瘀血、氣逆，肺之氣陰兩虛是肺癌發生、復發、轉移的關鍵。因此，他確立治則重在標實祛邪、正虛治本，治法重在化痰泄濁、活血祛瘀、行氣降逆以及益氣養陰，進而總結出了一種治療肺癌的臨床經驗方——克方?？朔接啥献?、法夏、膽南星、山慈菇、貓爪草、金蕎麥、魚腥草、仙鶴草、蘇木、紅花、沙參、玉竹、麥冬等13味中藥組成。其中，法半夏等燥濕化痰；金蕎麥、魚腥草軟堅散結；仙鶴草、紅花活血化瘀；沙參、麥冬益氣養陰?？朔脚R床用量為163 g（生藥）/d，煎煮后口服。為了在臨床更好地推廣和使用湯藥，本實驗從動物急性毒性實驗和長期毒性實驗兩個方面對克方進行安全性評價[1-3]。

1 材料

1.1 儀器

ADVIA 2120全自動血液分析儀（德國Siemens公司）；7100全自動生化分析儀（日本日立公司）；全自動凝血分析儀（法國Stago公司）；BX41光學顯微鏡（日本Olympus公司）；BSA323S-CW分析天平（德國Sartorius集團）。

1.2 藥品

克方[南京中醫藥大學中藥化學教研室自制，棕褐色流浸膏，批號：20140916，規格：5 g（生藥）/ml]。

1.3 動物

ICR小鼠20只，SPF級，♀♂各半，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2012-0001]；SD大鼠120只，SPF級，♀♂各半，體質量60～80 g，購自浙江省實驗動物中心[許可證號：SCXK（浙）2014-0001]。

1.4 實驗環境

南京中醫藥大學實驗動物中心[動物中心批準使用許可證號：SYXK（蘇）2014-0001]。給藥前，動物先飼養、觀察1周。給藥后，同組每5只同性別動物合籠，用全價顆粒飼料（江蘇省協同醫藥生物工程責任有限公司供給）喂養，自由飲水。飼養環境溫度為（23±3）℃、濕度為50%～65%。

2 方法

2.1 急性毒性實驗

取ICR小鼠20只，適應性飼養1周后以隨機數字表法隨機分為正常對照組和克方給藥組?？朔浇o藥組小鼠每天ig給藥2次，藥液質量濃度為5 g（生藥）/ml，每次給藥量為35 ml/kg，兩次給藥間隔8 h；正常對照組小鼠ig等體積飲用水。連續觀察14 d，記錄小鼠行為、活動、體質量、糞便、死亡等情況。觀察期間若發生小鼠瀕死或死亡，則及時解剖進行尸檢觀察；未死亡小鼠于2周后處死，進行尸檢觀察。

2.2 長期毒性實驗

取SD大鼠120只（♀♂各半），適應性飼養1周后以隨機數字表法隨機分為正常對照組和克方高、中、低劑量組，每組30只（♀♂各半）?？朔礁?、中、低劑量組大鼠每天2次以7 ml/kg分別ig 5、2.5、1.25 g（生藥）/ml克方水煎液（分別對應成人臨床劑量的28、14、7倍劑量），正常對照組大鼠ig等體積飲用水，2次給藥間隔8 h。連續給藥12周后，每組取大鼠20只（♀♂各半），麻醉后腹主動脈取血，作血常規、凝血四項及血液生化指標測定。然后頸椎脫臼處死并解剖大鼠，作主要臟器的肉眼觀察、臟器系數計算并進行組織學檢查。恢復期停藥2周后，將剩余大鼠按上述要求進行同樣檢查[4-8]。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 急性毒性實驗結果

以克方350 g（生藥）/kg（5 g/ml×35 ml/kg×2次）劑量1日內分2次ig給藥的10只小鼠，僅給藥24 h內見小鼠自發活動減少，給藥24 h后恢復正常。在觀察時間內一般情況良好，毛色光滑，活動、攝食、糞便色澤與質地均正常，活動無減少；且2周內無死亡及其它異?，F象發生。14 d后處死小鼠，解剖無肉眼可見的病理性改變。

3.2 長期毒性實驗結果

3.2.1 一般情況 在克方70、35、17.5 g（生藥）/kg 3個劑量連續對大鼠ig給藥12周及恢復期2周內，各組大鼠一般情況均良好，外觀、行為、排泄物等方面均未見異常變化。

3.2.2 體質量與攝食量 體質量測定結果表明，克方高劑量組大鼠體質量增長緩慢，從第2周開始體質量與正常對照組大鼠比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余各組大鼠體質量與正常對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。攝食量檢查結果表明，克方高劑量組大鼠的攝食量減少，雄性大鼠從第2周開始、雌性大鼠從第3周開始，其攝食量與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余各組大鼠的攝食量與正常對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3.2.3 血常規 給藥12周后，克方高、中、低劑量組雄性大鼠的紅細胞分布寬度（RDW）、平均血紅蛋白分布寬度（HDW）均顯著降低，克方高、中劑量組雌性大鼠網織紅細胞（RET）水平顯著升高，與正常對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。恢復期，克方高、中、低劑量組雄性大鼠平均血小板體積（MPV）升高，克方高、中、低劑量組雌性大鼠平均血紅蛋白濃度（MCHC）降低，與正常對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上指標的變化均在本實驗室正常生理值范圍內，與供試品無相關性。

3.2.4 血液生化 給藥12周后，克方高劑量組雄性大鼠尿素氮（BUN）水平升高，雌性大鼠天冬氨酸轉氨酸（AST）水平升高；克方中、低劑量組雄性大鼠總膽紅素（TBIL）水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）?；謴推趦雀鹘M大鼠血液生化指標均未見異常，這提示臨床用藥要密切注意這一項指標的變化。其余有變化的血液生化指標都是由于SD偏小所致，同時變化幅度均在10%內，與供試品無相關性。

3.2.5 凝血四項 給藥12周后，克方中、低劑量組大鼠凝血酶原時間（PT）明顯縮短，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；克方給藥組大鼠的其余凝血指標與正常對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3.2.6 臟器系數 給藥12周及恢復期，各組大鼠心、肝、脾、肺、胸腺、腎、腎上腺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪等臟器系數與正常對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3.2.7 尸檢及病理組織學 經肉眼觀察，正常對照組和克方高、中、低劑量組大鼠各主要臟器均未見異常變化。光學顯微鏡觀察，克方高劑量組出現8只大鼠膀胱黏膜上皮細胞輕、中度變性和壞死、脫落，其中3只大鼠膀胱內可見大量沉積物，與正常對照組比較有明顯差異。這提示克方在所設高劑量下對大鼠膀胱有一定的毒性；其余各臟器未見實質細胞變性、壞死，未見間質血管擴張、充血、炎細胞浸潤等病理變化。恢復期未見大鼠膀胱及其他臟器有病變，這說明克方在所設劑量下對大鼠有膀胱靶向毒性且具有可逆性。

4 討論

急性毒性實驗中因克方毒性較小，預實驗中無法測定其半數致死濃度（LD50），故測定其最大耐受量。在本實驗中，小鼠灌服克方，一日最大耐受量為35 ml/（kg·d）×2次[350 g（生藥）/（kg·d），以正常人體質量為65 kg計，相當于成人臨床劑量的140倍]。小鼠給藥后24 h內見自發活動減少。其原因可能由于高劑量的藥物灌服后引起胃腸反應且方中紅花、麥冬等有一定的中樞抑制作用導致。本方中的魚腥草、仙鶴草、蘇木、紅花、玉竹等藥均可單獨測出其LD50，組方配伍后無法測出克方ig給藥后的LD50，這表明克方配伍可有效降低單味藥毒性?？赡苡幸韵聝蓚€原因：一是方中山慈菇和貓爪草的解毒作用；二是方中冬瓜子、魚腥草、紅花、沙參、玉竹、麥冬等藥均有不同程度的免疫促進作用，個藥間相互作用降低了整方毒性。根據本研究結果可知，克方在臨床140倍用量下未見對小鼠有明顯毒性反應，這提示臨床用藥較為安全。

長期毒性實驗中體質量、攝食量的結果檢查可見，克方高劑量組大鼠攝食量減少、體質量增長緩慢?？赡苡幸韵聨讉€原因：（1）可能與所設克方高劑量組給藥的質量濃度較高，影響了大鼠的胃腸活動有關；（2）方中冬瓜子、法半夏等對胰蛋白酶有抑制作用，影響了大鼠進食后的消化；（3）方中仙鶴草對大鼠在位小腸的蠕動也有部分抑制作用，降低了小腸的收縮幅度和張力，影響動物進食后的排泄活動?？梢?，可能是由于上述幾個因素影響了高劑量組大鼠的攝食量，進而導致該組大鼠的體質量增長緩慢。

由血液生化指標的檢查結果可見，給藥12周后僅見受試大鼠血清中BUN、TBIL、AST升高，這表明該方可能對肝、腎有一定的影響，這可能是由于半夏的肝、腎損傷毒副作用導致。但方中所用半夏為炮制品，毒副作用大大減輕，且停藥2周后，大鼠血液生化指標恢復正常，這表明克方對動物肝、腎功能指標的影響具有可逆性，并提示臨床用藥時應密切關注患者肝、腎相關指標的變化，定期監測。

由凝血四項的檢查結果可見，所設克方中、低劑量組連續給藥12周后，克方中劑量組大鼠PT縮短了0.56 s，低劑量組大鼠PT縮短了0.95 s，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；然而克方高劑量組大鼠PT與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），這可能與中藥多成分、多靶點的特點有關。方中法半夏、仙鶴草、麥冬等含有促凝血成分，而紅花中的紅花黃色素具有抗凝血作用，且抗凝血作用隨劑量的增加而增強。隨著克方給藥質量濃度的升高，紅花中紅花黃色素的抗凝血作用增強，逆轉了法半夏、仙鶴草、麥冬等藥物的促凝血作用?？朔礁?、中、低劑量組大鼠連續ig給予克方12周后與正常對照組比較，凝血四項指標僅見PT縮短，且都在正常值范圍內；恢復期大鼠凝血四項指標均無異常，且方中法半夏的凝血作用具有動物種屬專一性，對人不產生促凝作用?？梢姡朔綄δ捻椀挠绊憳O小。

病理檢查發現，連續給藥12周后，所設克方高劑量組大鼠出現8只大鼠膀胱黏膜上皮細胞輕、中度變性和壞死、脫落，其中3只大鼠膀胱內可見大量沉積物，與正常對照組比較有明顯差異。停藥2周后大鼠可恢復正常，這提示克方毒性的膀胱靶向性與可逆性。方中13種不同比例配伍的中藥尚未見有膀胱毒性的報道，且有研究證明方中魚腥草對膀胱炎有顯著的治療效果[9-10]。本實驗所設高劑量達到臨床人用劑量的28倍，可能是由于隨著給藥的劑量增加，超過了治療量而產生了膀胱毒性，所設中、低劑量克方分別對應臨床人用量的14、7倍，臨床人用量更接近所設低劑量，未見有明顯膀胱毒性。這提示臨床使用中應嚴格控制使用劑量，謹遵醫囑。

綜上所述，克方毒副作用較小。臨床使用過程中應在臨床醫師指導下定期監測肝、腎功能指標變化。由于方中含有仙鶴草，而仙鶴草中鶴草酚與食用油同服可增加鶴草酚的毒性，故建議臨床使用時叮囑患者清淡飲食。在克方安全性較好得到實驗驗證后，本實驗后續將進一步探討克方的有效性，并探討其可能的作用機制。

[1] 吳芳，姚佳琪，尹蓮.GC法同時測定周氏克金巖方揮發油配伍前后變化[J].中成藥，2013，35（5）：974.

[2] 韓曼，吳芳，張旭，等.周氏克金巖方中6種黃酮指標成分的UV在線檢測[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（9）：56.

[3] 黃震洲，陳美娟，熊飛，等.周氏克金巖方有效成分槲皮素促進肺癌細胞NCI-H460凋亡的相關機制研究[J].南京中醫藥大學學報，2012，28（3）：235.

[4] 李志強，詹君，常艷鵬，等.苦碟子注射液安全性再評價中的急毒及長毒研究[J].中國中藥雜志，2012，37（18）：2 828.

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[9] 李文標，唐錄英，鄧歡，等.魚腥草提取液膀胱灌注治療大鼠非細菌性膀胱炎的實驗研究[J].中華臨床醫師雜志：電子版，2015，9（8）：85.

[10] 湯宏濤.八正散加用大劑量魚腥草治療女性急性膀胱炎70例[J].河南中醫，2012，32（5）：633.

Study on Acute Toxicity and Long-term Toxicity of Kefang

ZHANG Guangji，YANG Fan，SHI Le，YIN Lian，XU Li（College of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

OBJECTIVE：To investigate acute toxicity and long-term toxicity of Kefang（KF），and to provide reference for clinical trial and rational drug use.METHODS：20 ICR mice were randomly divided into KF group（350 g/kg）and normal control group（drinking water），with 10 mice in each group；they were given relevant medicine intragastrically，twice a day（every 8 h），for consecutive 14 d；acute toxicity test was conducted.120 SD rats were randomly divided into normal control group（drinking water），KF high-dose，medium-dose and low-dose groups[5，2.5，1.25 g（crude drug）/ml]，with 30 rats in each group（half male and half female）；treatment groups were given relevant medicine intragastrically twice a day（every 8 h），for consecutive 12 weeks；long-term toxicity was conducted.RESULTS：The maximum tolerated dose of KF was 350 g/kg，which was equal to 140 times as clinical human dosage.Compared to normal control group，body weight of rats in KF high-dose group increased slowly and food intake decreased（P＜0.05 or P＜0.01）；red blood cell distribution width（RDW），hemoglobin distribution width（HDW），mean hemoglobin concentration（MCHC）of male rats were all decreased，while mean platelet volume（MPV）and reticulocyte（RET）were increased（P＜0.05 or P＜0.01）；these indicators were all in normal physiological range of our laboratory. BUN，TBIL，AST and ALT acitivies of KF high-dose groups increased（P＜0.05 or P＜0.01），and no abnormal change was found during recovery period；12 weeks after medication，prothrombin time of KF medium-dose and low-dose groups shortened（P＜0.05 or P＜0.01）；mild and middle degeneration and necrosis，denudation of bladder epithelial cells were found in 8 rats of KF high-dose group，no abnormality was found during recovery period.CONCLUSIONS：There was no obvious toxic effect on the mice in the dose of 140 times of the clinical dose.Continuous 12-week administration of KF will influence liver and renal metabolism of rats；KF shows reversibility toxicity to bladder.No deeper lesions or delayed lesions is found in rats during recovery period.

Kefang；Acute toxicity；Long-term toxicity；Rat；Mice

R994.1

A

1001-0408（2016）34-4777-03

2016-05-30

2016-09-09）

（編輯：林 靜）

江蘇省社會發展項目（No.BE2011848）；2015年度南京中醫藥大學科技創新風險基金項目（No.CX201505）

＊碩士研究生。研究方向：新藥安全性評價。E-mail：15861812316 @163.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：代謝性疾病藥理和毒理學研究、新藥安全性評價。E-mail：xuliglp@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.08