乳酸桿菌調節腸道黏膜屏障功能的研究進展①

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·專題綜述·

乳酸桿菌調節腸道黏膜屏障功能的研究進展①

曹力韓四海高紅麗任國艷陳秀金李松彪

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽471023)

益生菌是指攝入足夠的數量，對宿主健康能夠產生有益作用的活的微生物。益生菌可通過影響腸道微生物區系發揮對宿主的健康起促進作用。許多研究表明，益生菌對人的健康作用包括：緩解乳糖不耐受癥、免疫調節、降低糞便中的酶活及突變的發生、降低膽固醇及腸道疾病的發生。

乳酸桿菌作為益生菌通常用于治療和預防腸道感染和抗生素相關腹瀉。當前世界上流通使用的知名益生乳酸桿菌有：嗜酸乳桿菌NCFM (Lactobacillus acidophilus NCFM) 、干酪乳桿菌Shirota(Lactobacillus casei Shirota )、植物乳桿菌WCSF1(Lactobacillus plantarum WCSF1)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)等[1]。研究表明，一些乳酸桿菌能夠降低難辨梭菌相關腹瀉的復發率、預防早產兒壞死性小腸結腸炎。用包含乳酸桿菌的益生菌制劑可用于治療壞死性小腸結腸炎，其機制主要是加速了固有免疫應答基因的成熟，這種作用具有菌株特異性[2]。此外，乳酸桿菌在治療和預防炎性腸道疾病(Inflammatory bowel disease,IBD)[3,4]、直腸結腸癌的預防及腸易激綜合征的治療取得了良好的結果[5,6]。在腸道寄生蟲感染條件下，乳酸桿菌通過IL-10介導的宿主防御途徑促進了寄生蟲的排出[7]。以上報道顯示，乳酸桿菌在預防和治療腸道疾病方面具有重要的作用。

腸道黏膜形成了一道防御屏障，能有效地阻止腸道內細菌及毒素等有毒有害物質進入體內，以保證機體內外環境的穩定。腸道黏膜屏障主要包括：覆蓋于上皮表面的黏液層、由柱狀上皮細胞構成的上皮細胞層及腸黏膜免疫系統構成的免疫防御系統。對腸黏膜屏障功能和完整性的影響可能是乳酸桿菌有益于宿主的一個主要方面，這不僅體現在乳酸桿菌對腸道黏膜發育的促進作用和對炎癥過程的調節，也體現在其對黏膜細胞基因表達的調控。乳酸桿菌可通過保證腸黏膜的完整性來改善腸道屏障功能。本文就乳酸桿菌對腸道黏膜屏障功能調節的相關研究做一綜述。

1乳酸桿菌對腸道黏液層的調節

覆蓋于腸道表面的黏液層是腸道黏膜屏障完整性的組成部分，在阻止腸腔微生物及其產物穿過腸黏膜起到重要的作用。腸道黏液的主要成分為杯狀細胞及黏膜下腺的黏液分泌細胞分泌的黏液蛋白(Mucin,MUC)[8]。MUC是一種糖蛋白，其在腸道形成的凝膠層除了在機體與外環境之間形成保護性屏障外，還具有潤滑作用[9]。截至目前，所鑒定的MUC至少有11種：MUC1-4、MUC5A及MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC13和MUC20[10-12]。

Pullan等[13]報道，IBD患者黏液層厚度的降低將增強腸道微生物對免疫系統的刺激，進而延長炎癥的持續時間。黏液的分泌及其向腸腔轉移速度則是一種動態平衡關系，這種動態平衡關系將影響黏液層厚度。在潰瘍性結腸炎條件下，一些區域黏液層的缺乏可能是黏液分泌不足或過度的移向腸腔所致。Fyderek等[14]研究認為，IBD患者炎癥部位的黏液層較薄，且這與乳酸桿菌數目降低有關。最近研究報道顯示，腸道MUC2基因表達與乳酸桿菌菌株有關[15]。Caballero-Franco等[16]研究發現，包含乳酸桿菌的益生菌制劑可誘導結腸上皮細胞MUC基因的表達。這些報道表明，乳酸桿菌可調節腸道黏液層的厚度及黏液蛋白相關基因的表達。

三葉肽家族(trefoil factors，TFFs)是由杯狀細胞分泌的一種蛋白酶抗性因子,其分子量大小為12～22 kD。主要有3個成員：TFF1、TFF2和TFF3。TFF1和TFF2主要在胃部產生，而TFF3主要由小腸和大腸的杯狀細胞分泌產生[17]。研究表明，TFFs在維持腸道上皮完整性方面具有明顯的作用。在損傷黏膜的修復過程中，轉化生長因子(Transforming growth factor，TGF)和表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)等細胞因子可調節TFF2和TFF3的表達及控制上皮細胞的增值和遷移[18]。與EGF功能相似，TFF3通過促進有絲分裂也能夠提高上皮的修復能力[19]。而乳酸桿菌可提高腸道杯狀細胞的密度和改善腸道的屏障功能[20]，這種作用可能與TFFs的表達有關。

2乳酸桿菌對腸道上皮屏障功能的調節

腸道上皮屏障由單層柱狀上皮細胞及細胞間的緊密連接構成。飲食成分、胃腸道分泌的產物及藥物等各種物質可破壞上皮屏障，導致上皮的脫落和損傷的發生。此外，腸道上皮損傷后，將經歷一個損傷愈合的過程，這一過程需要鄰近損傷區域的上皮細胞向損傷區域遷移、增殖和分化。目前，已有研究關注乳酸桿菌對損傷上皮愈合及緊密連接結構恢復過程的影響和調節作用。

2.1乳酸桿菌對腸道上皮損傷愈合的調節Jones等[21]研究發現，乳酸桿菌可刺激腸道上皮細胞增殖，而增殖則對損傷上皮的愈合具有重要意義。提示乳酸桿菌可調節損傷上皮的重建過程。腸道上皮重建過程需要隱窩部新產生的細胞沿腸絨毛遷移以補充損失的細胞。這一過程也涉及腸隱窩干細胞分化成不同的細胞譜系，包括吸收細胞，杯狀細胞，Paneth細胞及不同類型的內分泌細胞。未分化上皮細胞的成熟和分化對于維持黏膜上皮的完整性和功能活性是非常重要的。Swanson等[22]發現，乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus strain GG,LGG)通過誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生調節細胞的遷移，同時增強了黏著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)磷酸化，而FAK則是激活細胞遷移的關鍵蛋白。提示乳酸桿菌可通過FAK途徑促進損傷上皮的修復。

2.2乳酸桿菌對上皮緊密連接結構的調節腸道上皮細胞間的緊密連接結構最初是通過電子顯微技術被人們所認識。透射電鏡下，相鄰細胞的頂膜和側面之間顯示出一系列被精確定位連接結構；冰凍刻蝕電鏡表明，有三個被精確定位的連接環繞每個細胞形成了一個連續纖維絲帶。緊密連接纖維絲由完整的膜蛋白復合物構成，并可結合到胞質斑蛋白上。胞質斑蛋白負責將緊密連接的胞質中組分系到細胞骨架上。緊密連接(tight junction，TJ)是一個多功能復合體，在鄰近細胞頂膜之間形成一個密封。TJ密封了兩個細胞之間細胞旁的空間，防止微生物和其他抗原物質于細胞旁途徑擴散通過上皮。TJ是一個動態的屏障結構，由于要與食物殘渣、病原體及共生菌等外部刺激相互作用，TJ將不斷地發生改變。TJ結構在限制病原體入侵的同時，它還能夠調節營養素、離子及水分的吸收。與TJ相關的蛋白包括ZO(Zonula occludens)蛋白、Occludin蛋白、Claudin蛋白家族和Tricellulin蛋白[23]。

許多體內外的研究已經表明，乳酸桿菌的菌株特性和劑量都會影響緊密連接蛋白的表達和分布[24-27]。Resta-Lenert and Barrett[28]研究顯示，乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)提高了HT-29細胞和Caco-2細胞的通透阻力。這種對上皮通透阻力的影響伴隨緊密連接蛋白磷酸化水平的維持或升高。用乳酸桿菌處理HT-29細胞和Caco-2細胞也導致P38、ERK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和JNK途徑的活化[28,29]。基因水平的研究表明，乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum MB452)改變了許多與緊密連接相關基因的表達水平，這些基因包括編碼Occludin蛋白、細胞骨架錨定蛋白及微管蛋白的基因[24]。動物模型實驗結果顯示，乳酸桿菌降低了腸道的通透性、改善了疾病狀態[30]。用包含多種乳酸桿菌的混合益生菌制劑預先灌服急性胰腺炎模型大鼠，結果顯示，乳酸桿菌可抵抗由氧化應激導致的腸道通透性的增加、細菌移位、上皮細胞凋亡和緊密連接蛋白的破壞[31]，這一作用可能與乳酸桿菌誘導的黏膜谷胱甘肽及谷氨酸半胱氨酸連接酶活性增加有關。

2.3乳酸桿菌對黏合鏈接的調節E鈣蛋白(E-cadherin,CDH1)是存在于上皮細胞間黏合鏈接結構中的鈣黏蛋白家族成員，也是微生物黏附的主要受體。編碼E鈣蛋白的CDH1 基因甲基化,以及E鈣蛋白的細胞外域水解,將導致上皮細胞間的黏合連接松解，有利于病原體如幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的定植，進而引起病理變化[32]。研究顯示，乳酸桿菌通過調節E鈣蛋白基因的表達水平，起到穩定黏膜屏障的作用，提供黏膜對病原體的抵抗力[33]。

以上報道提示，乳酸桿菌對損傷腸道上皮具有一定的修復功能。這種修復作用主要通過促進腸道上皮的增值和調節上皮細胞間的緊密連接及黏合鏈接結構相關蛋白來維持和改善腸道黏膜的完整性。

3乳酸桿菌對腸道上皮凋亡的影響

除了對緊密連接蛋白的影響，益生菌也能夠通過促進細胞的存活防止細胞因子及氧化劑誘導的上皮損傷。已有研究報道，乳酸桿菌(Lactobacillus GG)及其釋放的可溶性因子(P75和P40)通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)依賴的模式激活抗凋亡基因Akt，抑制促凋亡途徑(p38/MAPK)活化，從而阻止上皮細胞的凋亡[34,35]。這種凋亡水平的降低將有助于維持上皮屏障的完整性及降低黏膜屏障的破壞而增強對病原體的抵抗。另有一項體外研究表明，乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum 299v)提高了凋亡蛋白家族抑制劑成員(HIAP2/cIAP)的表達水平[36]。 Di等[37]的研究也顯示，乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri SF1183)所分泌的分子能夠與人的腸道細胞-HCT116相互作用，導致HCT116細胞的凋亡水平降低，從而表明，乳酸桿菌所介導上皮細胞的凋亡水平的降低，在保護上皮屏障完整性及重塑腸道黏膜組織穩態方面顯示出重要的調節作用。

4乳酸桿菌對腸道黏膜免疫屏障的調節

由腸系膜淋巴結、B細胞、輔助性T細胞、漿細胞和肥大細胞構成的腸道黏膜免疫系統形成了一道免疫防御屏障，在保護機體免受病原微生物的侵害方面發揮重要的作用。 乳酸桿菌可作為宿主非特異性的免疫調節劑，通過其本身或菌體成分刺激機體免疫細胞，產生細胞因子，促進巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞活化而發揮作用。乳酸桿菌還具有促進機體B細胞產生抗體而發揮特異性免疫的作用。

Roessler等[38]研究表明，乳酸桿菌能夠提高單核細胞和粒細胞的吞噬活性。乳酸桿菌也可使克羅恩病患者巨噬細胞產生大量的粒細胞集落刺激因子(CSF)，導致TNF-α水平降低[39]。表明乳酸桿菌對巨噬細胞有重要調節作用，乳酸桿菌與巨噬細胞相互作用在一定程度上是通過甘露糖受體(CD206)途徑實現的。

樹突狀細胞(DCs)是最重要的抗原遞呈細胞。乳酸桿菌對腸道黏膜DCs功能的調節及Treg細胞(調節性T細胞)的誘導作用日益受到關注。許多研究已經表明，乳酸桿菌通過誘導DCs的成熟、MHC(主要組織相容性復合體)及共刺激分子和活化因子的表達將抗原呈遞給T細胞來調節DCs的功能[40]。乳酸桿菌可誘導DCs分泌IL-12、IL-10、TNF-α等細胞因子。近期的研究顯示，乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus strain b240)通過TLR(toll樣受體)-2介導的途徑促進了DCs分泌IL-6、IL-10及IFN(干擾素)-γ等細胞因子[41]。一些研究也關注乳酸桿菌對Treg細胞的誘導作用。報道顯示，當T細胞與DCs培養時，特定的乳酸桿菌可誘導Treg細胞產生IL-10，這種Treg細胞具有輕度抑制外周CD4+T細胞的作用[42]。

現階段的研究認為，初始T細胞(Th0)激活后分化為三類細胞群：Th1型細胞、Th2型細胞以及上面所提到的Treg細胞。Th1和Th2兩類細胞的激活相互抑制。Th0向Th1和Th2的分化主要取決于初始致敏時的細胞因子環境。調節性T細胞是一類不同于Th1和Th2細胞，具有免疫調節作用的T細胞群體，這些細胞參與多種免疫性疾病發生的病理過程。

用小鼠大腸炎癥模型實驗表明，在乳酸桿菌與病原微生物共同應激下，乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum Lp91)與宿主免疫系統相互作用而起到保護效應，這種保護效應一定程度上是通過T細胞的免疫調節作用而實現，包括Th1和Th2的免疫應答反應[43]。Jiang等[44]用乳酸桿菌作為抗原表達載體研究發現，表達胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)和吞噬刺激素的乳酸桿菌能夠刺激固有免疫細胞分化，包括向輔助性T細胞和調節性T細胞的分化，誘導Th1和Th17產生應答反應并降低了Treg細胞的應答反應。乳酸桿菌通過激活MAPK信號途徑而使Th1細胞和Treg細胞做出應答反應[45]。此外研究還發現，乳酸桿菌(Lactobacillus.reuteri)通過對CD4+Foxp3+CD25+Treg細胞的調節作用，可救治飲食誘導的糖尿病和肥胖病，并有刺激Treg細胞發育的作用[46,47]。乳酸桿菌在不同生理和病理條件下所發揮的作用，通常是通過平衡Th1/Th2及誘導Treg細胞的發育和釋放相關的細胞因子對腸道黏膜屏障起到保護作用。

Kotani等[41]報道，在乳酸桿菌與腸道PPs(派伊爾氏淋巴結)分離獲得的DCs和B細胞共培養體系中，乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus Strain b240)能夠刺激B細胞產生大量的IgA。Sakai等[48]的研究也得出了相似的結果，即口腔灌服乳酸桿菌，增強了腸道IgA的表達量。IgA是機體產量最豐富的免疫球蛋白亞型，而分泌型IgA(sIgA)主要存在于乳汁、支氣管液及胃腸液等分泌液中，通常以二聚體的形式存在。能夠較長時間存在于腸道中發揮免疫功效。大約80%的IgA分泌細胞定位于腸道黏膜。缺乏IgA或影響IgA分泌將會提高機體對腸道毒素和病原體的易感性。腸道內環境的穩定需要TLR的參與，而乳酸桿菌能夠誘導TLR的信號轉導機制，進而發揮保護功能。TLR啟動信號轉導的意義在于：可以激活一系列重要的基因以及引起相應細胞的活化。

腸道黏膜的肥大細胞和NK細胞在腸道黏膜穩態及屏障功能的維持方面具有重要的作用，肥大細胞的缺失降低上皮細胞的更新及上皮細胞沿隱窩-絨毛軸的遷移[49]。乳酸桿菌對腸道黏膜屏障具有保護作用，但其對肥大細胞的影響尚未見報道。盡管有報道顯示，乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus)增強了脾臟NK細胞的活性和IFN-γ的產生，且這種作用是由于乳酸桿菌引起DCs產生IL-12，間接導致NK 細胞產生IFN-γ[50]，而乳酸桿菌在腸道黏膜對NK細胞的影響鮮有報道。

5結語

腸道黏膜所形成的屏障對人體的健康是必需的。當該屏障遭到破壞，大量的微生物抗原橫跨腸道黏膜，導致微生物抗原的免疫原性發生變化及腸道上皮通透性的增大。實踐證明，采用乳酸桿菌預防或治療炎癥及氧化損傷誘導的腸道屏障功能損壞是一條重要途徑。然而，不同臨床應用研究發現，一些條件下乳酸桿菌能夠降低腸道通透性，而某些條件下，乳酸桿菌的作用并不顯著；此外，乳酸桿菌對腸道通透性改善與臨床癥狀的變化并非總是一致的。所以，需要更多的研究去做以澄清乳酸桿菌與腸道屏障功能的變化及臨床癥狀之間的確切關系。近年來，乳酸桿菌作為免疫調節劑在國內外取得了迅速的發展，已成為一門新興的基礎學科和迅速增長的朝陽產業，一些特定乳酸桿菌菌種也應用于食品、保健、醫療及動物生產等領域。但在各領域的應用實踐中，合適菌株的篩選，才能為相關產品的開發和臨床試驗奠定基礎，才能保證其具有顯著的功效。此外，乳酸桿菌作用機制也值得探討，以促進其推廣應用，這一課題的深入研究也為預防和治療腸道疾病提供一條嶄新途徑。

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[收稿2015-03-20二次修回2015-12-21]

(編輯許四平)

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0419-05

作者簡介：曹力(1979年-)，男，博士，講師，主要從事益生菌與腸道黏膜免疫相關研究，E-mail:caoli2015@sina.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.028

①本文受河南科技大博士啟動基金(400913480041)及國家自然基金面上項目(31471658)資助。