轉錄因子KLF4與腫瘤EMT的分子機制研究進展

任曉麗，陳麗君，宋 暉，劉海霞，陳必良

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032)

【婦幼綜合研究】

轉錄因子KLF4與腫瘤EMT的分子機制研究進展

任曉麗，陳麗君，宋 暉，劉海霞，陳必良

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032)

上皮間質轉化(EMT)是一種在胚胎發育和損傷修復過程中的生理性改變，其是腫瘤發生和發展過程中的一種常見現象，但作用及機制尚不完全清楚。目前已經發現多個轉錄因子通過調控下游靶基因參與了EMT的發生過程，其中Krüppel樣因子4(KLF4)能夠活化上皮基因的表達，同時抑制間質基因的表達，在EMT發生過程中發揮著關鍵作用，可能是腫瘤治療的新靶點。該文系統地總結了轉錄因子KLF4在腫瘤EMT發展過程中的作用及分子機制。

轉錄因子KLF4；腫瘤；上皮間質轉化；分子機制

上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一種在胚胎發育和損傷修復過程中的生理性改變，其為腫瘤發生和發展過程中的一種常見現象，因此，其關鍵調控機制成為目前腫瘤研究的熱點之一。目前已經發現多個轉錄因子能夠通過轉錄調控下游靶基因，參與EMT的發生過程，包括Snail1、snail2、ZEB1、Twist等。新近研究發現，Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor，KLF4)能夠活化上皮基因表達的同時抑制間質基因的表達，調控EMT的發生[1-2]，并且有研究發現KLF4在多種腫瘤的EMT過程中發揮著關鍵調控作用[1]，但KLF4在腫瘤EMT中的具體作用仍少有總結。現對KLF4在腫瘤EMT中的作用及其相關機制進行綜述。

1上皮間質轉化與腫瘤惡性表型

EMT在胚胎發育過程中對于組織形態的發生有著重要的作用，最早由發育生物學者Garry Greenburg與Elisabeth Hay提出。近年研究發現，在成年人組織中EMT與纖維化疾病及腫瘤進展密切相關[3]。EMT包含一系列細胞學的改變，例如細胞間粘附的降低、細胞極性的喪失以及細胞基質的增加。EMT的標志性改變是上皮標志性蛋白的喪失，同時伴隨著粘附鏈接蛋白的喪失，包括E-cadherin、β-catenin和p120 catenin等以及緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudins表達的減少和異常。

EMT是一個嚴密的可逆轉化過程，表現為排列良好緊密連接的上皮細胞轉變成為無序的間質細胞。在這個過程中，緊密連接蛋白的表達減少或者位置異常能夠引起細胞緊密連接的破壞。與此類似，由E-cadherin等組成的粘附連接復合體發生解體，伴隨著細胞頂底極性的喪失和細胞骨架的重構。此后細胞獲得紡錘狀的、成纖維細胞樣的間質細胞形態，并表達間質細胞的成分蛋白，包括N-cadherin、vimentin、fironectin等。通過誘導多種調節EMT因子的表達，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在EMT的發生過程中發揮著調控作用。受到TGF-β調控的因子包括Snail and Slug。除了這些轉錄調節機制，TGF-β-smad2的過度活化能夠抑制一些重要的上皮標志基因如E-cadherin等，從而促進EMT的發生和建立。

Mjaatvedt等于1989年提出EMT與腫瘤細胞的增殖、侵襲和浸潤密切相關。EMT在實體瘤的侵襲前緣表現為上皮細胞標志的喪失和間質細胞標志的獲得，并在腫瘤的發生過程中發揮關鍵作用。獲得間質特征的細胞能夠從原位癌中游離出來并進一步侵入臨近組織，進入循環系統以及向遠端器官定植。EMT過程伴隨著上皮細胞喪失細胞間連接和頂底極性，細胞骨架的重建和成纖維細胞表型的形成，并能夠影響一系列的相關基因。通過抑制細胞連接復合物中E-cadherin、ZO-1、claudin-1等的表達，細胞失去細胞間的連接并相互分離。通過促進間質分子N-cadherin、vimentin、α-SMA以及細胞外基質collagens Ⅰ、Ⅱ的表達，細胞遷移能力增強并能夠侵入細胞外基質[4]。

在EMT過程中，E-cadherin的表達受到多種轉錄因子的抑制，包括鋅指結構轉錄因子中的E結合鋅指蛋白(zinc finger E-box-binding protein，ZEB)、snail和Twist等。這些轉錄因子是TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)等信號通路的下游蛋白。E-cadherin的喪失能夠將位于胞內與其相連的β-catenin釋放至胞漿，并進一步進入細胞核調控一系列基因的表達，促進腫瘤的進展。因此，深入研究這些上游轉錄因子在腫瘤EMT過程中的作用及其機制對腫瘤治療具有重要意義。

2對轉化生長因子β的概述

TGF-β屬于一個由超過40個分泌因子組成的超家族，包括TGF-β，bone morphogenetic proteins(BMPs)、myostatin等。這些多功能的細胞因子控制多種細胞功能，包括增殖、凋亡、干細胞維持、細胞分化、遷移以及免疫系統的調節。TGF-β分子最初產生時是無活性的TGF-β形式，由TGF-β和latency associated proteins(LAPs)結合組成。

TGF-β可以通過多種途徑得到激活。第一種，在thrombospondin-1(TSP-1)的誘導下，LAPs可發生形式上的改變，并進一步在蛋白酶介導下發生剪切；第二種，在外傷或炎癥條件下，αVβ6整聯蛋白表達上調，與TGF-β結合并活化后者；第三種，當局部微環境中的pH降低或者放射誘導活性氧產生時，TGF-β也能夠被活化；另外，肌纖維在基底部的機械壓縮也能夠活化TGF-β。以上4種機制最終都能夠引起具有活性的TGF-β的釋放，并與TGF-β受體結合而引起下游信號通路的激活。

2.1轉化生長因子β的雙向作用

TGF-β最初被認為是能夠引起成纖維細胞增殖和轉化的細胞因子。一種已經得到廣泛認可的觀點為TGF-β在腫瘤的發生和進展中發揮著基礎性的作用。1994年Sporn等的研究表明，TGF-β在腫瘤的增值和轉化過程中可能有正反兩方面的作用。在起始階段，TGF-β對正常和發生惡化前的上皮細胞增殖具有抑制作用；然而隨著腫瘤細胞的發展，TGF-β在腫瘤細胞局部分泌增多，并開始促進腫瘤細胞的形態轉變。同時TGF-β的功能與組織的類型和遺傳背景關系密切。在正常的上皮細胞中，TGF-β抑制細胞的增殖。Pera等最早于1984年在小鼠上皮中發現過表達TGF-β可以抑制角質細胞的增殖，并且在小鼠受到致癌因子刺激后，可以減少上皮腫瘤發生和異常增生發生的可能。相反，當TGF-β受體活性受到抑制后，則能夠促進上皮細胞的異常增生。以上結果提示TGF-β是一種腫瘤抑制因子。

2.2轉化生長因子β和上皮間質轉化的信號通路

在對哺乳類動物上皮細胞的早期研究中TGF-β包括NmuMG細胞和EpRas細胞。TGF-β可以誘發幾乎所有的EMT標志性改變，比如細胞粘附連接和緊密連接的喪失、細胞骨架的適應性改變、紡錘狀形態的出現和細胞運動性的增強。當把EMT理解為在單一細胞因子TGF-β作用下細胞分化的一種過程時，EMT將更好理解和分類。在這種假設的情況下，TGF-β誘導其他生長因子、細胞因子和趨化因子的產生和分泌。因此，這些因素共同作用參與了EMT的建立和腫瘤細胞的侵襲浸潤。

作為誘導EMT的一個典型的因子，TGF-β通過信號轉導分子SMAD和非SMAD兩條信號路徑重建細胞骨架和胞外基質，并最終調控控釋細胞活動和侵襲的基因[5]。SMAD蛋白在TGF-β誘導EMT過程中發揮重要作用，通過抑制smad2、smad3、smad4和過表達smad7能夠阻斷NmuMG細胞的EMT過程[6]。另外，TGF-β也能夠直接調控大部分的EMT轉錄因子(EMT-TFs，EMT transcription factors)。TGF-β通過smad信號上調HMGA2(high mobility group A2)啟動細胞的EMT，同時Thuault等于2006年在相關的體內實驗中也證實HMGA2的過表達能夠引起細胞侵襲。TGF-β和HMGA2的另一個作用對象是Snail1。Smad和snail聯合作用則能夠抑制E-cadherin和adenovirus receptor(CAR)的表達。

通過非經典信號路徑TGF-β也可以誘導EMT的發生。TGF-β通過活化MAPK/PI3K路徑調節細胞骨架的重組、細胞的遷移和侵襲，而這些正是EMT的特征性變化。同時，TGF-β還能夠通過ERK/MAPK and p38 MAPK路徑促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲。TGF-β也能夠上調Sox4的表達，從而在EMT過程中調節一組間質基因。同時，Sox4能再次活化經典TGF-β信號構成一個反饋路徑，使細胞保持EMT狀態[7]。在EMT過程中，TGF-β能夠活化TβRII，而TβRII通過磷酸化極性復合體蛋白Par6募集Smurf1泛素連接酶，后者促進RhoA降解并松解細胞骨架網絡，從而溶解緊密連接，最終破壞細胞極性，導致EMT發生。

3對Krüppel樣因子4的概述

Krüppel樣因子C端具有3個鋅指狀結構域，N端有轉錄活化結構域。KLFs通過與啟動子結合能夠調節一系列基因的表達，并影響細胞增殖、分化等多種細胞生物學過程。到目前為止，在人體中已有17種KLFs得到確認，其中KLF4最初也稱為gut-enriched Krüppel-like factor。KLF4含有5個外顯子，其cDNA編碼一個包含有470個氨基酸的蛋白質。在KLF4中有多種結構域，包括轉錄活化和抑制結構域、DNA結合結構域等。由于同時具有轉錄活化和抑制兩種結構域，KLF4既能活化也能抑制其下游的調控靶基因。最近的研究發現，KLF4在多種消化道癌癥中的表達呈下調趨勢，并且通過調控其靶基因，其在消化道腫瘤細胞的發生、增殖、分化等過程中發揮重要作用[8]。

3.1 Krüppel樣因子4在上皮間質轉化中的作用

EMT的發生過程中有大量的轉錄因子參與，包括Snail1、snail2、ZEB1、Twist等，而KLF4在EMT過程中則能夠活化上皮基因的表達，同時抑制間質基因的表達[1，9-10]。在肝細胞癌中，過表達KLF4能夠抑制其間質特征并促使細胞表現出更多的上皮特征，同時抑制其遷移和侵襲、增殖及肺轉移等。進一步的研究證實，KLF4能夠結合于Slug啟動子上并抑制其活性，而Slug的表達能夠部分逆轉KLF4引起的細胞表現改變[9]。在小鼠乳腺癌模型中，KLF4通過減少Snail的表達抑制EMT，而snail是介導EMT的重要轉錄因子[9]。KLF4在E-cadherin啟動子上的結合位點與ZEB2的有重合，兩者對E-cadherin啟動子的的活性發揮著相反的影響[1]。隨著研究的深入，目前已發現KLF4對EMT過程中的許多關鍵性的分子都具有轉錄調控作用，包括E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin等[10]。

3.2 Krüppel樣因子4在腫瘤發生中的作用

KLF4作為一個轉錄因子在多種腫瘤的發生發展過程中發揮著腫瘤抑制因子的作用[13]。在腫瘤的早期發生過程中，KLF4的表達即表現出下調的現象。隨著腫瘤形成并進入進展期，KLF4的表達呈現出逐漸降低的趨勢。針對胃癌的研究發現，KLF4隨著腫瘤從Ⅰ期發展到Ⅳ期，其表達有明顯的漸進性消失的趨勢[2]。同樣，在人胃癌細胞系中，KLF4無論在mRNA水平還是蛋白水平都表現出表達減少的現象。與周圍正常黏膜中的表達相比，KLF4在腸癌中的表達也有明顯的降低。Wei等于2006年在對腸癌組織的研究中發現，與正常組織相比KLF4的表達降低甚至消失。Patel等于2010年在基礎研究中同樣發現，過表達KLF4能夠降低癌細胞克隆形成，抑制細胞遷移和侵襲。作為一種腫瘤抑制因子KLF4能夠抑制FOXM1的轉錄，而后者作為致癌因子對腫瘤的發生和進展有重要影響。Katz等于2005年通過基因技術獲得了KLF4突變的小鼠模型，發現小鼠胃上皮增殖明顯，并出現了異常分化[11]。

3.3 Krüppel樣因子4在增殖和分化中的作用

KLF4對腫瘤發生的影響主要是通過抑制細胞周期、促進細胞凋亡以及抑制增殖實現的。食管癌細胞中KLF4表達的減少能夠使細胞增殖活躍并降低細胞的粘附能力。同時，過表達KLF4則能夠促進食管癌細胞中DNA的修復并抑制其增殖，促進其凋亡。KLF4也能夠調控細胞周期。過表達KLF4的細胞會停留在G1期和S期的交界。CDKs(cyclin-dependent kinases)作為一種調節細胞周期的激酶，其自身活性受到KLF4的調控。KLF4也能夠促進p21等CDKs抑制因子的表達并抑制DNA的合成。除了促進上述因子的表達，KLF4也抑制一些促進細胞周期調節因子的表達。通過競爭性結合于細胞周期蛋白D1的啟動子，KLF4可以抑制其在mRNA和蛋白水平的表達。與此同時，KLF4在頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌等腫瘤中能夠促進腫瘤發育及進展，從而扮演致癌基因的角色。KLF4在腫瘤細胞中功能的發揮受到腫瘤類型以及腫瘤微環境等多種因素的影響。

KLF4在終末分化的表皮層中表達明顯。Segre等于1999年研究發現當KLF4表達缺失時，小鼠表皮的晚期分化會遭到破壞，進而使得皮膚屏障功能喪失，從而使得新生小鼠迅速死亡。在消化道癌癥中，KLF4起著促進癌細胞分化的作用。在食道癌中，過表達KLF4能夠通過促進鱗狀上皮細胞分化相關基因SPRR1A(small proline-rich protein 1A)等的表達誘發細胞的分化。在癌干細胞中，KLF4僅在球形細胞中過表達，并且敲低其表達能夠明顯地減少癌干細胞的標志分子、降低其藥物抵抗以及遷移等[12]。

3.4 Krüppel樣因子4在notch、wnt信號中的作用

Notch信號在細胞產生、增殖及分化過程中發揮重要作用，同時在很多種腫瘤的形成及發展過程中扮演重要角色。在notch信號活化的經典路徑中，首先是notch蛋白殘基和受體的交聯，然后蛋白水解并且notch細胞內結構域轉移入細胞核。在細胞核中，notch與DNA結合蛋白協同調控目的基因的轉錄表達。近來的研究發現，notch信號路徑在生理及病理條件下都參與EMT的發生[13]，并且KLF4與notch之間的關系可能與KLF4在EMT中的作用有關。在小腸的發育過程中，notch信號調節高柱狀細胞分化可能是通過KLF4實現的，因為KLF4能夠抑制小腸細胞的增殖及腸上皮細胞的終末分化[14]。在角質形成細胞中，KLF4結合至notch1的啟動子上抑制其轉錄表達，從而下調notch1基因抑制腫瘤的發生[15]。KLF4在超過70%的乳腺癌細胞中表達，發揮致癌基因的功能并有助于維持乳腺癌干細胞。下調KLF4的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。2009年Liu等更進一步的研究證實，notch信號在KLF4介導的細胞遷移和侵襲中發揮關鍵作用。KLF4能夠直接結合于notch1的啟動子上，并且在癌細胞中抑制KLF4的表達能夠引起notch1的表達減少。另一方面，在腸癌細胞中過表達notch則能夠降低KLF4的表達水平，抑制其活性并促進細胞增殖。因此，KLF4與notch也能夠相互影響，并最終影響到KLF4在EMT中的作用。

參與調控癌細胞過程一個重要的信號通路是經典wnt/β-catenin信號路徑。在癌癥發生過程中，活化的wnt信號能夠促進β-catenin的核轉移，并引起與腫瘤侵襲轉移有關的基因表達。目前，有研究證實wnt/β-catenin信號路徑參與了癌細胞的EMT過程[16]，并且與KLF4信號有關聯。在許多正常細胞和癌細胞中，KLF4能夠激活β-catenin與啟動子的結合。當直腸癌中的腫瘤抑制因子APC(adenomatous polyposis coli)發生突變失活時，wnt信號會因為β-catenin的聚集而持續升高。在腸癌細胞系中，APC通過活化KLF4啟動子能夠調節KLF4的表達。過表達KLF4能夠降低β-catenin的蛋白和mRNA水平，同時下調KLF4的表達則促進β-catenin的聚集。以上結果表明KLF4可能是通過APC/β-catenin信號發揮抑制作用。另外，Zhang等在2006年還有研究發現，在保證正常小腸細胞內環境穩定的過程和直腸癌發生的過程中，KLF4與β-catenin的交互影響都發揮著關鍵作用。因此，KLF4與wnt信號的作用可能也參與EMT的發生。

3.5 Krüppel樣因子4與轉化生長因子β之間的聯系

目前一個公認的觀點是TGF-β在腫瘤發生發展過程中具有雙重作用。在起始階段，它抑制細胞增殖，促進凋亡，從而抑制腫瘤形成，但是在腫瘤發展的后期，TGF-β呈現為一種過表達的狀態，并通過誘導EMT促進腫瘤的發展。有研究表明，KLF4能夠影響TGF-β引起的EMT，并且減少KLF4的表達能夠加快TGF-β誘發EMT的過程。在TGF-β誘導的前列腺癌EMT模型中，Slug是調控EMT起始的關鍵調控分子，而TGF-β誘導的KLF4的表達降低是此過程進行的必要條件[17]。受到TGF-β刺激后，KLF4的表達水平通過泛素蛋白酶系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)發生降解[18]。在血管平滑肌細胞的分化過程中，KLF4通過活化Smad2/3和p38MAPK路徑傳遞TGF-β信號，同時它也可以直接結合于TGF-β啟動子上調控smad信號。

綜上所述，KLF4在腫瘤EMT過程中發揮關鍵作用，其與TGF-β信號之間有密切的交叉反應，可能通過與TGF-β信號協同作用影響腫瘤細胞EMT過程，但其具體機制仍需要進一步研究。

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[專業責任編輯：安瑞芳]

Research progress of molecular mechanism of transcription factor KLF4 and epithelial mesenchymal transition

REN Xiao-li; CHEN Li-jun; SONG Hui; LIU Hai-xia; CHEN Bi-liang

(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China)

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a physiological change during embryonic development and injury repair process, and it is a common phenomenon in the process of occurrence and development of tumors. But its role and mechanism are still unclear. Currently, it has been found that several transcription factors are involved in EMT process through the regulation of downstream target genes. Among them, Krüppel like factor 4 (KLF4) can active the epithelial gene expression while inhibit stromal gene expression, which plays a key role in EMT genesis and may be the new target for tumor therapy. The aim of this review was to systematically summarize the role and molecular mechanism of transcription factor KLF4 in the development of EMT in tumor.

transcription factor KLF4; tumor; epithelial-to-mesenchymal transition (EMT); molecular mechanism

2016-05-26

國家自然科學基金資助項目(項目編號：81301921)；陜西省自然科學基金資助項目(項目編號：2013JM4023)

任曉麗(1983-)，女，主治醫師，在讀碩士研究生，主要從事宮頸癌的研究。

陳必良，教授/博士生導師/主任醫師；宋 暉，副教授/副主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.045

R730.26

A

1673-5293(2016)11-1426-04