骨髓間充質干細胞對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能的臨床研究①

張東鋒　王煜姝　滕軍放

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

·生物治療·

骨髓間充質干細胞對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能的臨床研究①

張東鋒王煜姝滕軍放②

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治療對肝豆狀核變性肝纖維化患者肝功能及其血清學指標的影響。方法：將60例確診肝豆狀核變性肝纖維化患者隨機分為：青霉胺組、BMSCs組和BMSCs+青霉胺組。無菌條件下進行骨髓干細胞采集、分離、鑒定。青霉胺組：口服青霉胺(每日40 mg/kg),12周；BMSCs組：將骨髓間充質干細胞液2 ml+生理鹽水100 ml經(jīng)外周靜脈移入人體，10 d 1次，3次為一個療程；BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時經(jīng)外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。分別于治療0、4、8、12周檢測血總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)、血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 的含量，并做組間比較，分別于治療前后做肝組織病理活檢。結果：BMSCs+青霉胺組肝組織活檢肝纖維化整體改善較其他兩組明顯；各組TBIL、ALT、ALB、CHE、PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α均持續(xù)降低，但BMSCs+青霉胺組中肝功能改善和細胞因子的降低比其他組更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：BMSCs聯(lián)合青霉胺治療對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能有明顯改善。

[關鍵詞]肝豆狀核變性；肝功能；骨髓間充質干細胞；青霉胺

肝豆狀核變性(Hepatolenticular degeneration，HLD)因伴隨銅離子代謝失衡，常導致多器官受累。肝臟作為最主要的代謝場所更易受到損害，如若發(fā)展為肝硬化乃至失代償其治療更為棘手[1]。為探索HLD肝纖維化患者的治療，現(xiàn)收集我院肝豆狀核變性肝纖維化患者，并使用骨髓間充質干細胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)聯(lián)合青霉胺治療，研究該治療對HLD合并肝纖維化患者肝功能以及相關細胞因子的改變。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料肝豆狀核變性患者合并肝纖維化患者來源于我院住院患者，均已明確診斷。排除標準：患者年齡18~65歲；孕婦或哺乳期婦女；合并心、肺、腎等重要臟器功能不全者；嚴重感染者；伴有惡性腫瘤者；合并如肝性腦病、肝腎綜合征、上消化道大出血等嚴重并發(fā)癥患者；合并嚴重出血傾向者；過敏體質等其他嚴重情況影響治療者。選取我院住院患者60例，男性32例，女性28例，年齡18~50歲，平均年齡(28.92±7.25)歲；入組患者生命體征平穩(wěn)，所有治療患者在知情同意的情況下，簽定《知情同意書》。

1.1.2藥物、試劑及儀器青霉胺(0.125 g/片，上海信誼制藥公司)，生理鹽水(100 ml，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，2%利多卡因(天津藥業(yè)集團)，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，Percoll分離液(美國GE Healthcare公司)，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國R&D)。

1.2方法

1.2.1實驗分組將符合納入標準的患者隨機分為三組：青霉胺組、BMSCs組、BMSCs+青霉胺組。①青霉胺組：給予青霉胺(40 mg/kg)口服，12周。②BMSCs組：將3×106細胞/ml的BMSCs液2 ml加入100 ml生理鹽水，經(jīng)外周靜脈移入人體，10 d1次，3次為一個療程。③BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時經(jīng)外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。

1.2.2骨髓干細胞采集、分離、鑒定①術前做好患者思想工作，安撫緊張情緒。②無菌條件下，使用2%利多卡因局部麻醉，于雙側髂后上棘進行骨髓穿刺，抽取骨髓約50~80 ml，加入肝素抗凝。③以2 000 r/min×20 min離心骨髓，去除上層脂肪細胞，用等量DMEM培養(yǎng)液將骨髓稀釋為細胞懸液。④將細胞懸液加入Percoll分離液，離心1 200 r/min ×25 min。⑤吸取細胞層，使用生理鹽水洗脫，1 500 r/min×5 min，重復3次。⑥使用生理鹽水重懸細胞，細胞計數(shù)在1×108/L~10×108/L之間，4℃保存。⑦使用流式細胞儀進行BMSCs表面標記測定： CD44、CD90為陽性(均大于90%)，CD34、CD45為陰性(均小于5%)。

1.2.3實驗室檢查分別于治療前和治療后4、8、12周抽取病人外周血5 ml，測定血中總膽紅素(Total bilirubin,TBiL)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)的值。測定血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 、白介素6(Interle-ukin-6，IL-6)的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測，具體操作步驟詳見說明書。

1.2.4肝組織病理標本實時B 超引導下經(jīng)皮肝組織穿刺活檢術，由配套活檢槍使用16G活檢針進行，保證所取的肝組織標本長1.2~1.8 cm。標本經(jīng)連續(xù)切片后作常規(guī)伊紅染色和網(wǎng)狀纖維染色，根據(jù)1995年中華醫(yī)學會肝病分會肝纖維化分期診斷標準，將纖維化分為S0~S4期。S0期，無纖維化；S1期，匯管區(qū)纖維化擴大；S2期，匯管區(qū)周圍纖維化纖維間隔形成，小葉結構保留；S3期，纖維間隔形成伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4期，早期肝硬化。(肝纖維化病理分期與肝血流動力學、肝纖維化指標的關系)。由專門的病理學醫(yī)師進行診斷及分析。

2結果

2.1不同組血清中TBIL和ALT表達各組中治療12周后TBIL和ALT較治療前均有所降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05(圖1、2)。

2.2不同組血清中ALB和CHE表達各組中治療12周后ALB和CHE較治療前均有所升高，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組升高最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05(圖3、4)。

2.3不同組血清細胞因子表達治療12周后各組中PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α各類細胞因子較治療前均降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05(圖5~8)。

2.4肝組織病理檢查結果肝組織病理檢查顯示青霉胺組纖維化分期2例由S2期變?yōu)镾1期，BMSCs組5例由S2期變?yōu)镾1期，3例由S3期變?yōu)?/p>

S2期，BMSCs+青霉胺組7例由S2期變?yōu)镾1期，3例由S3期變?yōu)镾2期，3例由S3期變?yōu)镾1期，2例由S4期變?yōu)镾3期(圖9)。

3討論

HLD由于銅離子排泄障礙而在肝內緩慢蓄積，導致肝細胞壞死，纖維組織增生，引起細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)在肝內不斷沉積，進而導致纖維化。肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時發(fā)展為肝硬化的初期階段，而肝纖維化甚至早期肝硬化可以逆轉已成為共識[2,3]。因此探討HLD肝臟受損初期改善肝功能逆轉肝纖維化的治療就顯得尤其重要。

BMSCs因易于取材，便于分離培養(yǎng)，具有較強的分化潛能，并且可自體移植，越來越受到學者們的青睞，被認為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細胞。目前國內外有大量研究表明，骨髓間充質干細胞可以通過分化為肝細胞進而有效改善肝功能，并且有較少的副作用[4-6]。肝纖維化進程中PDGF-BB、TGF-β1等細胞因子發(fā)揮著關鍵作用，多種細胞因子參與肝星狀細胞的激活和肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7,8]。

PDGF是近年來開始研究的一個細胞因子,在肝纖維化形成過程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明PDGF-BB在肝纖維化進展過程中更為重要[10]。血清PDGF-BB水平可以影響肝臟損傷和肝纖維化[11]。已有研究表明PDGF可以通過激活PDGF-b R/NLRP3/caspase1 通路促進炎癥因子的釋放[12]。BMSCs可能通過干擾PDGF信號通路引起血清中PDGF減少而發(fā)揮改善肝功能的作用，但具體分子機制仍需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs和青霉胺治療后炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6均有所下降。青霉胺可以促進銅排出，減輕肝臟損傷，BMSCs促進肝細胞恢復再生，進而導致影響肝功能的炎癥因子減少。TGF-β1在肝纖維化初期發(fā)揮關鍵作用，主要作用是促進ECM合成并抑制其降解，血漿TGF-β1水平與肝纖維化程度正相關[13]。研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs(如miR-31)可以通參與TGF-β/Smad3信號通路調節(jié)肝纖維化[14]。TNF-α可以通過活化TGF-β和PDGF等細胞因子并與之形成調節(jié)網(wǎng)絡，調節(jié)基質金屬蛋白酶參與肝纖維化[15,16]。TNF-α與PDGF等細胞因子可導致Kupffer細胞大量釋放炎癥因子,進而參與肝損傷過程[17]。IL-6可以聯(lián)合TNF-α共同刺激Kupffer細胞，釋放諸如TGF、PDGF等細胞因子,形成正反饋作用,產生更多的ECM[18]。可見BMSCs和青霉胺可以降低血清中多種細胞因子的表達，有利于促進肝功能的恢復，但其具體分子機制不一而同，需要進一步動物實驗才能驗證。 總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)在運用青霉胺聯(lián)合BMSCs治療HLD肝纖維化時，可能通過協(xié)同作用降低各類損傷肝臟的細胞因子進而使肝功能得到改善。國內外已有大量研究表明干細胞移植可以緩和肝纖維化，改善肝功能，并且具有較廣泛的應用范圍[19,20]。進一步提示骨髓間充質干細胞治療技術有望在治療HLD肝纖維化中得到更廣泛的臨床應用。

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[收稿2015-04-20修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Clinical research about liver function of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis by transplantation of bone marrow stem cells

ZHANGDong-Feng，WANGYu-Shu，TENGJun-Fang.ZhengzhouPeople′sHospital，Zhengzhou450003，China

[Abstract]Objective:To evaluate the influence of bone marrow stem cells (BMSCs) in the serological indicators of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.Methods: 60 cases were randomly divided into 3 groups: penicillamine group, BMSCs group and BMSCs+penicillamine group.BMSCs(2 ml)were injected into vein with normal saline(100 ml) every 10 days ( 3 times for a period of treatment).Liver tissue pathology biopsy was inspected and TBIL, ALT, ALB, CHE, PDGF-BB, TGF-β1, IL-6 and TNF-α were detected at 0,4,8 and 12 weeks.Results: The level of serological indicators about liver functions were reduced in every group, while the changes in BMSCs+penicillamine group were especially obvious (P<0.05).Conclusion: Penicillamine combined with BMSCs was effective in the improvement of liver functions of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.

[Key words]Hepatolenticular degeneration；Liver function;Bone marrow stem cells；Penicillamine

作者簡介：張東鋒(1976年-)，男，在讀博士，副主任醫(yī)師，主要從事運動障礙病方面研究，E-mail:zhangdongfeng_hn@163.com。

中圖分類號R742.4
①本文為鄭州市科技計劃項目(121PPTGG494-1)。
②鄭州大學第一附屬醫(yī)院，鄭州450052。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0193-05