草甘膦抗性菌株假單胞菌P818的篩選鑒定

王冰+杜錦+向春陽+王松文+曹高燚

摘 ? ?要：5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是除草劑草甘膦的靶標酶，轉基因抗草甘磷作物主要通過轉入外源EPSPS編碼基因或者對外源EPSPS定點突變來獲得。為了擴充草甘膦抗性基因資源，篩選新型草甘膦抗性基因，本研究分離篩選并獲得了一株新型草甘膦抗性菌株，16srDNA鑒定顯示該菌株屬于假單胞菌，該菌株被命名為假單胞菌818。該菌株的獲得為進一步篩選克隆草甘膦抗性相關基因提供了可靠保障，豐富了草甘膦抗性基因資源庫，獲得自主知識產權的新型草甘膦抗性基因有利于應對國外生物技術公司對該領域的壟斷，有利于我國遺傳改良作物的培育。

關鍵詞：5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶;草甘膦;假單胞菌;抗草甘膦作物

中圖分類號：S482.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.007

Screening and Identification of Glyphosate-Resistant Strain Pseudomonas818

WANG Bing，DU Jin， XIANG Chunyang， WANG Songwen， CAO Gaoyi

（College of Agronomy and Resources and Environment， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： 5-phosphoenolpyruvate shikimic acid acyl-3-phosphate synthase （EPSPS） is the target enzyme of glyphosate. Over expressed exogenous EPSPS gene or site-directed mutagenesis of endogenous EPSPS are the major strategies to gain glyphosate resistant crops. In order to expand the glyphosate resistance gene resources， the glyphosate polluted soil was screened for identifying new glyphosate tolerant microbes. A novel glyphsoate resistant strain was separated which was named as Pseudomonas818 after the amplification of 16 s ribosome DNA. The strain will provide some useful information for cloning glyphosate resistant gene. The research could supplement the bank of glyphosate resistant genes and get rid of the restriction of foreign biotechnology companies. All in all， the novel discovery could provide some useful signals for crop genetic improvement.

Key words： 5-phosphoenolpyruvate shikimic acid acyl-3-phosphate synthase （EPSPS）;glyphosate;Pseudomonas;glyphosate-resistant crops

草甘膦（Glyphosate）作為一種重要的除草劑，具有高效、低毒、在環境中降解快、廣譜滅生等優良特性，且制備工藝簡單。草甘膦因其種種突出的特性，使其在幾十年間得以迅速發展，并成為當今農業生產中生產量及銷量最大、使用面積最廣的一種除草劑。草甘膦的作用機理主要是競爭性地抑制莽草酸途徑中的催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和三磷酸莽草酸（S3P）生成5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸（EPSP）的5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），通過占據EPSPS與底物結合的活性位點導致莽草酸途徑的受阻，進而使植物體內莽草酸大量積累，最終使植物產生草甘膦毒害[1]。EPSPS由aroA基因編碼，主要分為I型、II型及III型等3類。I型EPSPS主要來源于植物、大腸桿菌（Escherichia coli）及部分微生物，一般對草甘膦敏感，不具有草甘膦抗性;II型EPSPS主要來源于農桿菌（Agrobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）等一些可以耐受極端環境的菌株，一般對草甘膦具有耐受性;III型EPSPS由于其結構上的特異性將其單獨列出，此類EPSPS數量較少。

生物體為了解除草甘膦的脅迫作用，主要通過4種途徑來獲得草甘膦抗性：（1）過量表達EPSPS獲得草甘膦抗性;（2）定向進化EPSPS，降低對草甘膦的敏感而獲得草甘膦抗性;（3）降解草甘膦;（4）通過非靶向性的調控作用獲得草甘膦抗性[2]。這4種途徑也是利用現代農業生物技術培育抗草甘膦作物的主要策略。

在現代農業生產中，生物技術所占比重越來越大，抗草甘膦轉基因作物在國內外得到了飛速的發展，然而困擾抗草甘膦轉基因作物發展有一個重要因素就是稀缺的基因資源。當前廣泛應用于轉基因作物生產的草甘膦抗性基因，主要是來源于Agrobacterium的CP4及來源于E.coli等I型EPSPS的TIPS突變體（第97位的Thr突變為Ile，第101位的Pro突變為Ser）[3-4]，以及由先鋒公司開發的草甘膦乙酰轉移酶基因GAT[5]。我國抗草甘膦轉基因作物的發展與國外相比存在不小的差異，其中一個重要的原因就是緊缺的基因資源或者是少數性狀優良的基因資源由于專利因素被國外公司牢牢把控?；诖?，應該擴寬草甘膦抗性基因的來源，獲取新型的草甘膦抗性基因，推動我國現代農業的發展。本研究通過逐步稀釋法篩選草甘膦污染土壤微生物，分離獲得一株新型草甘膦抗性菌株假單胞菌818。新的草甘膦抗性菌株的篩選鑒定，為下一步克隆草甘膦抗性基因奠定了基礎。