土壤微生物對黃花蒿凋落物或青蒿素的響應

李倩，袁玲，楊水平，黃建國

(西南大學資源環境學院，重慶 400716)

土壤微生物對黃花蒿凋落物或青蒿素的響應

李倩，袁玲，楊水平，黃建國*

(西南大學資源環境學院，重慶 400716)

摘要：黃花蒿主要通過植株殘體向土壤釋放化感物質，影響土壤肥力和生產力。本試驗開展了土壤微生物對黃花蒿凋落物和青蒿素的響應研究。結果表明，在土壤中添加黃花蒿凋落物和青蒿素，真菌數量增加，但顯著降低放線菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌的數量，不利于土壤有機質礦化，生物固氮和硝化作用。黃花蒿凋落物和青蒿素降低微生物熵，增大代謝熵，說明土壤微生物代謝受到干擾，活性降低。此外，黃花蒿凋落物和青蒿素還使土壤微生物標記性磷脂脂肪酸總量和種類以及細菌、放線菌和原生動物標記性磷脂脂肪酸減少，選擇性地抑制了土壤微生物的繁殖生長。在黃花蒿凋落物、青蒿素和對照(不加凋落物和青蒿素)的土壤中，微生物種群結構差異顯著，黃花蒿凋落物和青蒿素降低微生物多樣性和均勻度指數。因此，在大規模集約化種植黃花蒿的過程中，進入土壤的凋落物抑制有益微生物生長繁殖，改變土壤微生物群落結構，種群減少，密度降低，這可能是黃花蒿抑制后茬和周圍植物生長，進而造成減產的重要原因之一。

關鍵詞：凋落物；黃花蒿；青蒿素；土壤微生物；磷脂脂肪酸

Responses of soil microorganisms toArtemisiaannualeaf litter or artemisinin

LI Qian, YUAN Ling, YANG Shui-Ping, HUANG Jian-Guo*

CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China

Abstract:Artemisia annua releases many kinds of allelochemicals into soils via dead plant residues, either by rain leaching or root exudation. Dead leaves of A. annua contribute more than 80% of the total artemisinin that enters soils during the growth period of A. annua. Allelochemicals released by the dead leaves reduce the growth and yields of succeeding and adjacent crops. Soil microbes play roles in nutrient transformation, organic matter recycling, toxicant decomposition, and hormone efflux, and thus, are important for plant growth and development. However, little is known about the effects of these allelochemicals on soil microorganisms. In these experiments, artemisinin and A. annua leaf litter were each added to soil and changes in microbial biomass and community structure were evaluated. The growth and reproduction of culturable microorganisms in soils showed wide variations in response to A. annua leaf litter or artemisinin. For example, the number of fungi increased but the numbers of actinomycetes, azotobacteria, nitrobacteria, and nitrite bacteria significantly decreased in soils containing A. annua leaf litter or artemisinin. The results suggested that both leaf litter or artemisinin inhibited organic matter mineralization, nitrogen bio-fixation, mobilization of phosphorus and potassium, and nitrification. The soil microbial quotient decreased, while the metabolic quotient increased, after A. annua and artemisinin were added to soils. This result indicated that artemisinin and other allelochemicals in the leaf litter interfered with the metabolism of soil microorganisms. The types and total contents of signature phospholipid fatty acids of microbes such as actinomycetes and protozoa decreased in soils containing leaf litter or artemisinin. The diversity and evenness indices of the microbial community also decreased, suggesting that the soil microbial ecosystem deteriorated as the densities of various microbial groups decreased. Therefore, artemisinin and allelopathic chemicals released from A. annua leaf litter affect the microbial community structure in soils, and may pose a risk to soil ecosystems in the areas where A. annua is widely cultivated. Further research is required to clarify the mechanisms by which allelopathic chemicals from A. annua change the structure of microbial communities in soil.

Key words:litter; Artemisia annua; artemisinin; soil microorganism; PLFAs

黃花蒿(Artemisiaannua)屬菊科草本植物，俗名青蒿，在我國已有兩千多年的藥用歷史，是提取抗瘧疾的首選藥物——青蒿素的唯一原料藥材[1]。在黃花蒿生長過程中，主要通過植株殘體(貢獻率>80%)向土壤生態系統釋放多種化感物質，如倍半萜類、黃酮類、香豆素類和揮發油類等[2-5]。其中，青蒿素和甲氧基黃酮最為豐富，直接或者間接抑制植物生長發育[3]。因此，大規模栽培黃花蒿嚴重影響周圍及后茬作物的生長發育，造成大幅度減產甚至絕收[6]。

Dhingra等[7]發現，青蒿素及其合成前體——青蒿酸能夠抑制發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生長。青蒿油能有效殺滅金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeraginosa)和芽孢桿菌(Bacillus)[8]。將青蒿素加入種植和未種植黃花蒿的土壤中，后者的細菌數量比前者降低51%，說明青蒿素選擇性地抑制了土壤細菌的生長繁殖[9]。醫學研究表明，青蒿素干擾細菌生理代謝，其臨界濃度極低，2.4 mg/kg就會產生明顯作用[10]。進入土壤中的青蒿素分解緩慢，35~60 d后仍然高于檢測極限[11]，對土壤微生物產生持續作用。總之，黃花蒿釋放的化感物質影響土壤微生物的群落結構，但有關研究尚待深入。

土壤是植物生長的場所，亦是土壤微生物天然的培養基，微生物釋放多種土壤酶，驅動有機質降解、腐殖質合成、養分循環、污染物降解等生物化學過程與有機質礦化，是土壤肥力和生產力的基本要素之一。在此基礎上，本文研究黃花蒿凋落物和青蒿素對土壤微生物群落結構的影響，為降低黃花蒿的化感效應和保持土地生產力提供理論依據。

1材料與方法

1.1　供試材料

供試土壤為重慶市典型、具有代表性的灰棕紫泥，中壤質地、pH 6.13、有機質14.72 g/kg、全氮1.12 g/kg、全磷0.54 g/kg、全鉀16.22 g/kg、堿解氮28.27 mg/kg、有效磷19.07 mg/kg、速效鉀92.57 mg/kg。采集0~20 cm耕作層，揀去雜物，過3 mm 篩，加水至最大田間持水量的(70±2)%。土壤加入葡萄糖6 mg/kg，培養24 h，活化微生物，再加入400 mg 尿素混勻，取500 g土壤置于750 mL聚乙烯盒中。

田間采集黃花蒿新鮮凋落物(主要為葉片和葉柄，內含10.5 mg青蒿素/g)，涼干，粉碎過1 mm篩。青蒿素購自重慶市中藥研究院(純度≥95%)。

1.2　試驗設計

2013年，在黃花蒿生育期，進入土壤的凋落物總量可達2.4 g/kg (0~10 cm)~4.8 g/kg (0~5 cm)[12-14]， 約等于24~48 mg 青蒿素/kg干土。因此，在每kg供試土壤中，分別加入2.4和4.8 g黃花蒿凋落物，以及24和48 mg 青蒿素，混合均勻，不加凋落物和青蒿素的為對照，依次用A1、A2、A3、A4和CK表示。(28±1)℃恒溫培養20 d(在土壤中，青蒿素的半衰期為0.9~13 d)[11]。備測有關項目，試驗設置6次重復。

1.3　測定項目與方法

培養結束后，利用稀釋平板分離計數法測定土壤中的細菌(牛肉膏蛋白胨培養基)、真菌(馬丁氏培養基)、放線菌(高氏一號培養基)，自生固氮菌(Ashby無氮培養基)；MPN法測定土壤氨化細菌(蛋白胨瓊脂培養基)、亞硝化細菌(改良Stephenson培養基A)和硝化細菌數量(Stephenson改良培養基B)[15]；土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸-0.5 mol/L K2SO4提取，提取液中的微生物生物量碳用K2Cr2O7氧化法測定；土壤基礎呼吸采用室內密閉培養-1 mol/L NaOH堿液吸收法測定; 微生物熵為微生物生物量碳與總有機碳的比值， 土壤微生物代謝熵(qCO2)即土壤微生物基礎呼吸與土壤微生物生物量碳之間的比值[16]。

微生物磷脂脂肪酸(phosphorlipid fatty acids，簡稱PLFAs)的命名、提取和分析參照文獻[17-19]。操作步驟為：每個處理取3個重復，各重復取10 g 的新鮮土樣于50 mL的離心試管中，加入20 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液，混勻后 37℃溫育1 h，每10 min渦旋1次，確保磷脂脂肪酸釋放并甲脂化。加入3 mL 1 mol/L的醋酸溶液中和pH值后搖勻。加10 mL正己烷，800 r/min離心15 min后，經N2將上層正己烷干燥后，溶解于1 mL體積分數為1∶1的正己烷甲基丁基醚溶液中，利用氣相色譜(Hewlett-Packard 6890)測定其含量。色譜條件為：HP-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管色譜柱；升溫程序為 70℃ 保持 5 min，20℃/min升至190℃，保持1 min，5℃/min升到200℃，停留2 min，10℃/min升到280℃，保留8 min；進樣口溫度：250℃；載氣：He(0.9 mL/min)；分流比：10∶1；離子源溫度：230℃；四極桿：150℃；質譜全掃描范圍：30～600 m/z。以甲酯化的 C19:0(non-adecanoate)為內標，Bacterial Acid Methyl Esters Mix (47080-U, Sigma-Aldrich)為外標，微生物標記性磷脂脂肪酸的分類見表1。

表1　微生物標記性PLFAs分類

注：i、a、cy和Me分別表示異丙基、反異丙基、環丙基和甲基分支脂肪酸；ω后跟的數字表示出現雙鍵的碳原子位序；c和t分別表示該雙鍵為順式構型和反式構型。

Note: i, a, cy and Me areiso-, anteiso-,cyclopropylandmethylbranchingfattyacids,respectively.ω,candtrefertothealiphaticend, cis-andtrans-configurationsoffattyacids.

1.4　數據處理

用土壤PLFAs含量計算土壤微生物的種群特征值，包括多樣性指數、均勻度指數和優勢度指數等。

Pielou均勻度指數J′ 的計算公式為：J′=H′/lnS；

其中，Pi=Ni/N，Ni為iPLFAs含量，N為微生物的PLFAs總量，S為PLFAs總含量[20]。

用Excel 2007對試驗數據進行基本計算，SPSS 19.0進行統計分析。單因素方差分析(one way-ANOVA)檢驗不同處理間差異顯著性，CANOCO 4.5主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)不同處理間土壤微生物群落結構差異，顯著水平設置為P<0.05。

2結果與分析

2.1　土壤微生物數量

由表2可知，加入黃花蒿凋落物后，土壤中的可培養細菌、真菌和氨化細菌數量增加，但放線菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌數量減少；加入青蒿素后，土壤中的真菌數量顯著增加，氨化細菌無顯著變化，其余可培養微生物的數量均顯著下降，當青蒿素的濃度為4.8 mg/kg時，細菌、放線菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌的數量分別下降61.9%，66.2%，77.3%，16.0%和52.6%。

表2　不同處理對土壤微生物數量的影響

注：在同一列中，平均值±標準差后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: In each column, the average ± standard error (n=12) followed by different small letters are significantly different atP<0.05. The same below.

2.2　土壤微生物活性

由表3可知，加入黃花蒿凋落物之后，土壤呼吸強度相對于CK提高(A2)或無顯著變化(A1)，微生物生物量碳和微生物熵顯著降低，微生物代謝熵增加。加入青蒿素之后，土壤微生物生物量碳、土壤呼吸強度和微生物熵相對于CK降低，微生物代謝熵提高。

表3　土壤微生物活性

表4　青蒿素和黃花蒿凋落物處理土壤中微生物PLFAs含量

注：在同一行中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Data followed by different small letters in the same row are significantly different atP<0.05.The same below.

2.3　微生物磷脂脂肪酸(PLFAs)

由表4可知，在CK、A2和A4處理土壤中，分別檢測出33、29和26種標記性PLFAs，包括代表細菌的12:00、a14:0、14:00、i14:0、15:02OH、15:03OH、a15:0、i15:0、i15:1、16:00、10Me16:0、a16:0、i16:0、16:12OH、16:01、16: 1ω9c、17:00、a17:0、cy17:0、i17:0、i17:03OH、18:00、i18:0、11Me18:1w7c、Cy19:0w8c、i19:0、20:00和20:1w9c，代表放線菌的10Me 17:0和10Me18:0，代表真菌的18:1w9c 和18:3w6c (6,9,12)，以及代表原生動物的20:4w6,9,12,15c。

從PLFAs總量看，CK最高，達到920.00 μg/g，A2次之，為668.37 μg/g，A4最低，僅485.00 μg/g。加入黃花蒿凋落物和青蒿素之后，代表G+細菌的PLFAs降低了38.6%~56.3%，代表G-細菌的PLFAs降低了18.1%~44.5%，代表細菌(G-+G+)的PLFAs總量降低了30.5%~54.6%，代表原生動物的PLFAs降低了49.3%~74.7%，代表放線菌的PLFAs降低了34.6%~53.0%，代表真菌的PLFAs提高了47.0%~109.7%。

在加入黃花蒿凋落物的土壤中，14:00、i14:0、15:0 3OH、i15:0、16:00、a16:0、i16:0、16:12OH、16: 1ω9c、17:00、a17:0、cy17:0、i17:03OH、i18:0、10Me18:0、11Me18:1w7c、20:00、20:1w9c和20:4w6,9,12,15c等PLFAs含量顯著下降，未檢測到a14:0、15:0 2OH、18:3w6c (69,12)和i19:0 4；12:00、 a15:0、i15:1、10Me16:0、16:01和18:00無顯著變化。在加入青蒿素的土壤中，未檢測到12:00、i14:0、15:0 2OH、i15:1、16: 1ω9c、18:3w6c (6,9,12)和i19:0 7；a15:0,i17:0和cy19:0w8c 無顯著變化；其余PLFAs顯著降低。但是，加入黃花蒿凋落物和青蒿素之后，代表真菌的18:1w9c含量顯著增加，G+/G-降低，真菌/細菌增加。

2.4　微生物群落特征

表5是利用PLFAs計算獲得的土壤微生物種群特征值。其中，多樣性指數和均勻度指數CK顯著高于A2和A4處理；相反，在A2和A4處理的土壤中，微生物的優勢度指數變化于0.920~0.938之間，A2顯著高于CK (0.903)。

2.5　土壤微生物群落PLFAs結構分析

圖1是不同處理的土壤中，微生物標記性PLFAs(相對含量大于2%)的主成分結構變異。

表5　利用PLFAs獲得的土壤微生物種群特征值

圖1　土壤微生物群落磷脂脂肪酸組成的主成分分析Fig.1　Principal component analysis of PLFAs in soil microorganism communities

其中，主成分PC1和PC2分別表示不同群落間92.6%和5.2%的變異度。代表CK、A2和A4不同處理的點在主成分坐標體系中分布距離較遠，CK位于右下方(象限IV)，A4位于左下方(象限III)，A2基本位于正上方。

3討論

青蒿素屬于倍半萜類化合物，主要在葉片中合成[21-22]。在黃花蒿生長過程中，葉片的凋落量可達葉片總量的34%，凋落葉片中含有大量的青蒿素及其合成前體——青蒿酸[7,12,23]。將黃花蒿凋落物加進土壤之后，在微生物的作用下分解釋放出青蒿素和青蒿酸。本項研究表明，在土壤中添加黃花蒿凋落物和青蒿素，可以選擇性地抑制或促進土壤微生物的生長繁殖。研究證明，黃花蒿提取物也選擇性地抑殺人畜病原微生物，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecalis)、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和黑曲霉(Aspergillusniger)等[7,23-27]。此外，黃花蒿凋落物和青蒿素也顯著抑制土壤放線菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌的生長繁殖。放線菌參與土壤有機質循環，形成土壤結構，分泌抗生素[28]；自生固氮菌不僅能生物固氮，而且還能分泌生長激素，活化土壤磷鉀[29-30]；硝化細菌和亞硝化細菌參與土壤硝化作用，直接影響植物對氮的吸收利用[31]。因此，土壤有益微生物減少不利于植物生長發育，危害土壤健康功能。

微生物代謝熵(qCO2)是土壤基礎呼吸強度與微生物生物量碳的比值，反映土壤微生物的碳源利用效率。代謝熵愈大，微生物呼吸消耗的碳源越多，用于構造生物體的碳源越少，碳源的利用效率也越低[32]。抗生素和惡劣環境均能干擾微生物代謝活動，提高或降低呼吸強度，增大代謝熵，降低生長繁殖速率[33-34]。此外，青蒿素類衍生物可以通過抑制線粒體和質膜上的電子傳遞呼吸鏈，致使線粒體膜去極化，活性氧及細胞色素C含量增加，最終誘導細胞凋亡[35]。將大量的黃花蒿凋落物(A2)加入土壤之后，提高土壤呼吸強度，高濃度的青蒿素(A4)可以降低土壤呼吸強度，但微生物代謝熵均顯著增加，表明青蒿素干擾了土壤微生物體內的物質和能量代謝，碳源利用效率降低，細胞構建受到抑制，導致生長繁殖速率下降。這可能是加入黃花蒿凋落物和青蒿素之后，土壤放線菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌數量減少，微生物標記性PLFA總量降低的重要原因之一。

在對照、添加黃花蒿凋落物和青蒿素的土壤中，微生物標記性PLFAs分別為33、29和26種，說明黃花蒿凋落物和青蒿素使土壤微生物種群減少。其中，黃花蒿凋落物和青蒿素對標記性PLFAs的影響因微生物種類不同而異；代表細菌總量，G+/G-細菌、放線菌和原生動物等的標記性PLFAs不同程度地降低，真菌/細菌增加，說明黃花蒿凋落物和青蒿素選擇性地抑制了土壤微生物的生長繁殖，影響微生物的群落結構，與前人的研究結果一致[9]。青蒿素能有效殺滅引起人類瘧疾的原生動物——瘧原蟲，成為治療瘧疾的首選藥物[36]，黃花蒿凋落物和青蒿素也使土壤原生動物標記性PLFAs降低。在土壤中，蚯蚓和線蟲等是最重要的原生動物。蚯蚓參與土壤有機質轉化，結構形成，還能分泌生長活性物質，與土壤肥力和生產力密切相關，蚯蚓數量減少意味著土壤肥力和生產力降低。但是，線蟲通常引起植物根系病害，黃花蒿凋落物和青蒿素抑殺土壤線蟲，可以作為生物農藥用于防治作物根系病害。因此，取利避害是黃花蒿集約化栽培中尚需研究的課題之一。

土壤微生物群落PLFAs組成的主成分分析結果顯示，代表對照、添加黃花蒿凋落物和青蒿素處理的點在主成分坐標體系中分布于不同位置，且距離較遠，說明這3種土壤微生物群落結構差異顯著。從它們的群落特征值來看，黃花蒿凋落物和青蒿素降低微生物群落的多樣性指數和均勻度指數。多樣性指數表示生物群落中的物種數量，數值愈大表示生物群落中的物種越豐富；均勻度指數越大，生物群落中的種群密度越高[37-38]。一般而言，在穩定良好的生態環境中，有益于微生物的生長繁殖、種群增加、密度增大、多樣性指數和均勻度指數較高，反之亦然[39-40]。在加入黃花蒿凋落物和青蒿素的土壤中，微生物多樣性指數和均勻度指數降低，說明土壤環境惡化，微生物種群減少，密度降低。

總之，黃花蒿凋落物和青蒿素對土壤微生物的影響因種類不同而異，它們的標記性PFLAs含量下降，種類減少，群落結構改變，多樣性指數和均勻度指數降低。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail: huang99@swu.edu.cn

作者簡介：李倩(1987-)，女，河南鄭州人，在讀博士。E-mail:qianqingzi@qq.com

基金項目：國家973計劃項目(2013CB127405)和中央高校基金(SWU113094)資助。

收稿日期：2014-10-13；改回日期：2014-11-17

DOI：10.11686/cyxb2014425http://cyxb.lzu.edu.cn