農桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉化菊苣的初步研究

張玉,白史且,李聰

(1.四川省草原科學研究院，四川 成都611731；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100094)

農桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉化菊苣的初步研究

張玉1*,白史且1,李聰2

(1.四川省草原科學研究院，四川 成都611731；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100094)

摘要：含硫氨基酸具有動物營養與免疫相關的重要生理功能，為提高菊苣中含硫氨基酸含量，采用根癌農桿菌介導法將玉米種子貯藏蛋白含硫氨基酸基因γ-zein和綠色熒光蛋白GFP融合基因轉入到菊苣無菌苗葉片中，經過共培養、潮霉素抗性篩選、分化、再生和煉苗, 得到抗性植株。對抗性植株進行PCR、PCR-Southern、斑點雜交和RT-PCR分析，結果表明,外源目的基因已經整合到菊苣基因組中并且得到了表達，為提高菊苣含硫氨基酸含量，改善其品質奠定了基礎。

關鍵詞：γ-zein基因；菊苣；農桿菌轉化；含硫氨基酸

Preliminary studies on transgenic chicory using the sulphur-amino acid gene, γ-zein, mediated byAgrobacteriumtumefacien

ZHANG Yu1*, BAI Shi-Qie1, LI Cong2

1.SichuanGrasslandScienceAcadem,Chengdu611731,China; 2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100094,China

Abstract:Sulfur-containing amino acids have important physiological functions related to animal nutrition and immunity. To improve the sulfur-amino acid content of chicory, leaves of chicory were transformed with the Sulphur-amino acid gene γ-zein, an important prolamin storage protein from Zea mays and a green fluorescent protein (GFP) gene using Agrobacterium mediated transfusion. After co-culture, selective differentiation and regeneration, hygromycin resistant plants were obtained. Resistant plants were detected using PCR, PCR-southern, dot blot hybridization and RT-PCR. The results demonstrated that the γ-zein genes had been integrated into the genome of chicory and expressed on a nucleic acid level in the transgenic plants.

Key words:γ-zein genes; chicory (Cichorium intybus); agrobacterium-mediated transformation; sulphur-amino acid

蛋白短缺包括蛋白含量短缺和營養品質低下，是21世紀全球性的嚴重問題，在盡快提高作物品種的蛋白質含量的同時，積極改善蛋白質的氨基酸組成，提高營養價值，具有重要意義。

含硫氨基酸如甲硫氨酸(也稱為蛋氨酸,methionine,Met)、胱氨酸、半胱氨酸(cysteine, Cys)等是合成蛋白質的重要氨基酸，蛋白質中含硫氨基酸的含量與種子萌發、生長和作物品質均有密切關系。含硫氨基酸是人體必需氨基酸之一，也是形成動物毛發角蛋白的必需組分，并且研究表明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛產量22%以上，增產的幅度在22%~104%[1-2]，同時還可增加牲畜的重量，含硫氨基酸的這種獨特作用是別的氨基酸不具有的[2]。如能提高牧草或動物飼料中含硫氨基酸的含量，對提高動物重量、改善動物品質，具有重要的經濟價值。是穩定畜產品價格和確保畜產品安全的有效途徑之一[3]。

菊苣(Cichoriumintybus)為菊科菊苣屬多年生宿根草本植物，其適應性廣，根系發達，產量高，營養豐富，粗蛋白質16.44%～27.35%，菊苣常用作牧草飼料、蔬菜、制糖原料及咖啡的替代品，也是工業和藥品的生產原料[3-4]。雖然菊苣蛋白質含量高，但是蛋白質中氨基酸組成不平衡，含硫氨基酸含量較低。

近年來，基因工程的誕生使人類的農業生產史發生了巨大的變化，通過轉基因技術提高植物抗性、改善織物品質，具備并已展現了巨大的應用價值和經濟價值[5]。目前已經從玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、向日葵(Helianthusannuus)及豌豆(Pisumsativum)等中分離得到富含硫氨基酸的蛋白及其編碼基因。玉米醇溶蛋白(zein)是玉米種子中的主要貯藏蛋白質，可分為α-、β-、γ-和δ-zein 4種主要類型。其中β-、γ-和δ-zein富含蛋氨酸和半胱氨酸2種含硫氨基酸[6]。通過轉γ-zein基因來提高植物的含硫氨基酸已經在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]、白三葉草(Trifoliumrepens)[9]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[10-11]等中取得良好的結果。γ-zein基因的成功轉入和表達為增加牧草可食性組織的含硫氨基酸含量提供了新的途徑，但這在菊苣上還沒見報道。本文通過農桿菌介導將GFP和γ-zein融合基因轉化菊苣，對獲得的轉基因植株進行檢測，以期提高菊苣植株含硫氨基酸的含量，改善菊苣品質，同時也為菊苣新品種的培育提供中間材料。

1材料與方法

1.1　植物材料

普那菊苣(Cichoriumintybuscv. puna)由四川省草原科學研究院提供。普那菊苣是一個產量高、抗蟲性強的國家登記牧草品種。

1.2　質粒及菌種

本實驗中使用根癌農桿菌菌株LBA4404、植物表達載體pCAMBIA1302和γ-zein基因均由中國農業科學研究院畜牧獸醫研究所李聰實驗室提供。質粒圖譜見圖1。該質粒包括CaMV35S啟動子、γ-zein、GFP蛋白基因。

圖1　植物表達載體pCB-GFP-zein結構Fig.1　Schematic maps of plant expression vectors pCB-GFP-zeinLB為左邊界Left T-border;RB為右邊界Right T-border.

1.3　試驗用培養基成分

見表1。

1.4　方法

1.4.1菊苣無菌苗的獲得選取飽滿菊苣種子，經體積分數75%乙醇浸泡2 min，倒出浸泡液，再用0.1%的升汞浸泡10 min，無菌水反復清洗4~5次，無菌濾紙吸干水分后， 接種于1/2 MS培養基上，放于溫室，待植株成苗。

表1　培養基成分

1.4.2菌液的活化參照王關林和方宏藥(2002)的方法，略有變動。取-80℃加入15%甘油保存的菌液于碎冰上融化，用接種針蘸取少量菌液，在添加有50 mg/L Kan和50 mg/L Str的固體平板培養基上劃線，于28℃恒溫培養箱中倒置暗培養2 d。待長出單菌落后，用牙簽挑取單菌落于含50 mg/L Kan和50 mg/L Str的液體LB或YMB培養基中，振蕩培養16～24 h至對數生長期，然后按1∶100比例轉入不含抗生素的新鮮液體培養基中繼續振搖培養至OD600達0.6左右。無菌條件下取新鮮菌液于50 mL離心管中于常溫5000 r/min離心10 min，去除上清液，用1/2 MS無菌液體培養基重懸沉淀至需要的OD值，用于侵染轉化。

1.4.3轉基因抗性植株的獲得選取無菌苗中上部充分展開、生長健壯、均勻一致的幼嫩葉片，用5～10 mm打孔器制取葉盤外植體，將其接種在預培養基中預培養2 d后，用OD600=0.4 Abs農桿菌菌液浸泡10 min, 其間不斷搖動，取出后用無菌濾紙吸取受體表面多余菌液，迅速將受體材料移置鋪有一層無菌濾紙的共培養基上，黑暗中共培養到有肉眼可見微菌落。共培養結束后，將其轉入含25 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養基中篩選得到抗性芽。當抗性芽長到1 cm時，轉入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養基中擴繁，將擴繁芽轉入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養基中進行生根培養，直到長成完整的小植株，然后馴化移栽，得到轉基因抗性植株。

1.4.4抗性植株的檢測1) PCR檢測

用CTAB法和普博欣植物基因組DNA小量提取試劑盒提取抗性植株及對照(未轉化植株)的總DNA，根據標記基因GFP和目的基因γ-zein序列用primer 5.0設計引物進行PCR擴增，GFP引物序列為：

5′-CAGTGGAGAGGGTGAAGGTG-3′

5′-CGAAAGGGCAGATTGTGTGG-3′

預期擴增長度為538 bp。

γ-zein引物序列為：

5′-TGCCACTACCCTACTCAACCG-3′

5′-GGAGGACCAAGCCGAAGAT-3′

預期擴增長度為283 bp。

以質粒pCB-GFP-zein作為陽性對照，以未轉化的植株作為陰性對照。PCR反應體系為：10×PCR Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，基因組DNA 1 μg Taq DNA Polymerase(5 U/μL) 0.5 μg, 添加 ddH2O 補充到 25 μL。PCR反應程序為：94℃ 4 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s， 72℃ 1 min，30個循環， 最后72℃ 10 min。電泳完后，取5 μL PCR擴增產物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測擴增結果。

2) PCR-Southern

以質粒pCB-GFP-γ-zein DNA 為模板進行PCR，對PCR產物進行回收，用回收產物做探針標記，具體標記方法見Roche 公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，然后對PCR 產物進行電泳、轉膜、預雜交、雜交和顯色檢測，具體方法見Roche 公司的說明書。

3)斑點雜交

對陽性植株DNA變性，冰中速冷。在帶正電荷尼龍膜上用鈍鉛筆劃0.5 cm×0.5 cm方格網，先用蒸餾水浸潤尼龍膜，然后用20×SSC浸泡，用Tip將變性DNA點于膜上，以質粒pCB-GFP-zein DNA為陽性對照，以未轉基因植株為陰性對照，每個樣點2~10 μg DNA，室溫晾干，烘烤，進行預雜交、雜交和顯色檢測[12]。

4) 轉基因植株RT-PCR檢測

利用TRIzol法對菊苣陽性轉化植株和非轉化植株的總RNA進行提取、純化，然后對RNA進行反轉錄。逆轉錄反應體系為25 μL，含模板RNA 2 μg，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，M-MLV Reaction Buffer 5 μL，Dntp (10 mmol/L) 5 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL，M-MLV RT 200 U，加DEPC水補足25 μL。用γ-zein基因引物對反轉錄的cDNA進行PCR檢測和電泳分析。

2結果與分析

2.1　轉基因菊苣獲得

菊苣無菌苗葉片預培養2 d后，葉片邊緣開始膨大，用含pCB-gfp-zein的LBA4404浸染，浸染后的菊苣葉片(圖2A)在黑暗下共培養2~3 d，轉于含20 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養基上，20 d后分化出具有抗性的不定芽(圖2B)，將抗性芽轉入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養基中擴繁1~2周 (圖2C)，再轉入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養基中進行生根培養，2~3周后植株生根(圖2D)發育成完整植株(圖2E)，煉苗室內盆栽，最終獲得48株形態特征正常的菊苣抗性再生植株 (圖2F)。

圖2　轉化菊苣分化與再生Fig.2　Differentiation and regeneration of transformed chicory　A:浸染后的菊苣葉片Leaf soaked of chicory；B:不定芽的篩選(箭頭指向為抗性芽) Screen the Hyg-resistant regeneration buds (the arrowed places are the transgene buds);C: 抗性植株生根培養Radicating of the Hyg-resistant regeneration buds； D:抗性芽的分化Differentiation of the Hyg-resistant regeneration buds；E:完整的抗性植株Intact plant；F:移栽成活的抗性植株The survival Hyg-resistant regeneration plant transplanted to plate.

2.2　抗性植株的PCR檢測

提取轉化抗性植株DNA，用GFP基因和γ-zein基因引物分別對轉化植株及非轉基因植株總DNA進行PCR擴增，結果顯示轉化的48株抗性再生植株中有29株能擴增出γ-zein基因的283 bp預期片段，只列出部分PCR圖(圖3)，有26株能擴增出GFP基因538 bp的預期片段(圖4，只列出部分PCR圖)，而非轉基因植株均未擴增出任何條帶(圖3,圖4)。

圖3　轉基因植株γ-zein-PCR 檢測Fig.3　PCR analysis of γ-zein gene from transformed chicory　　　1: DL 2000 DNA marker;2: pCB-gfp-zein質粒Plasmid pCB-gfp-zein;3:陰性對照(非轉基因菊苣) Negative control(non-transgenic );4~10:轉化植株Transformed plants.

圖4　轉基因植株gfp-PCR 檢測Fig.4　PCR analysis of gfp gene from transformed chicory

2.3　抗性植株的PCR-Southern檢測

對gfp 和γ-zein基因PCR檢測都為陽性的植株進行γ-zein-PCR——Southern檢測，檢測結果(圖5)表明：檢測的植株都為陽性，初步說明外源目的基因γ-zein已經轉化到菊苣基因組中。

圖5　轉基因植株γ-zein-PCR-Southern 檢測Fig.5　PCR-Southern analysis of γ-zein gene from transformed chicory

M: DL 2000 DNA marker; P: pCB-gfp-zein質粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉基因菊苣) Negative control(non-transgenic );1~7: 轉化植株Transformed plants.1: pCB-gfp-zein質粒Plasmid pCB-gfp-zein; 2: 陰性對照(非轉基因菊苣) Negative control(non-transgenic);3~7: 轉化植株Transformed plants.

2.4　抗性植株的斑點雜交檢測

對上面檢測均為陽性的轉基因植株DNA進行斑點雜交，所用探針為pCB-gfp-zein質粒DNA的γ-zein-PCR回收產物，雜交結果顯示(圖6)：除陰性對照外，轉基因植株都有雜交信號，說明γ-zein已經整合到菊苣基因組中。

圖6　轉基因植株γ-zein斑點雜交檢測Fig.6　Dot blot hybridization analysis of γ-zein gene　　　P: pCB-gfp-zein質粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉基因菊苣) Negative control (non-transgenic);1~8: 轉化植株Transformed plants.

2.5　抗性植株的RT-PCR檢測

采用TRIzol法對菊苣轉化植株和未轉化植株提取RNA，經檢測RNA質量良好(圖7)，經過RT-PCR檢測，結果表明(圖8),除1株為陰性外其余都為陽性，表明大部分基因在轉基因菊苣植株中得到了表達。檢測表明陰性的植株是假陽性，還是在RNA上沉默，還有待Southern雜交的進一步檢測。

圖7　提取的植株RNA Fig.7　RNA extraction of plants

圖8　轉基因植株γ-zein-RT-PCR 檢測Fig.8　RT -PCR analysis of γ-zein gene 　　　1: DL 2000 DNA marker; 2:pCB-gfp-zein質粒Plasmid pCB-gfp-zei; CK: 陰性對照(非轉基因菊苣) Negative control (non-transgenic);3~8: 轉化植株Transformed plants.

3結論與討論

改進農作物品質歷來為各國科學工作者所重視。菊苣中缺乏蛋氨酸和半胱氨酸, 蛋氨酸和半胱氨酸成了其營養限制,菊苣是一個多用途的經濟作物、藥用植物和飼料作物, 提高其蛋氨酸和半胱氨酸含量具有巨大的潛在經濟價值。該論文以菊苣無菌苗葉片為外植體，利用根癌農桿菌介導法對含硫氨基酸γ-zein基因和GFP基因的融合基因轉移到菊苣的研究，迄今還未見報道。在菊苣中利用基因工程法進行基因轉化的報道并不多見，目前在國內外報道的只有與花發育相關AFL2基因[13]、β-glucuronidase (uidA)基因[14]、抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因[15]、pBI121-GFP載體[16]、菊苣中分離克隆的DREB基因[17]和茅液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因(ALNHX)[18]被導入菊苣，并且這些報道都只做了最初的PCR檢測，沒有在RNA的表達上進行檢測。

在植物遺傳轉化中，預培養的主要作用是促進細胞分裂，因為處于分裂狀態的細胞更易整合外源DNA，提高轉化率。研究發現菊苣預培養時間比較短，只需要2 d即可，如果預培養時間超過3 d，外植體邊緣除了膨大外，還開始分化出綠點，影響轉化效率。根癌土壤農桿菌只能感染植物的損傷部位，在植物細胞損傷及修復過程中，植物細胞釋放出一些化學物質(酚類物質、酸性多糖等)，這些誘導物可以通過外膜蛋白將環境中的植物損傷信號傳遞到農桿菌細胞內，最終引起vir 基因的表達和T-DNA 的轉移。其中誘導效果最佳的為乙酰丁香酮(AS)，它可以使農桿菌質粒上的vir 基因活化，提高轉化率。也有報道稱AS對于轉化效果沒有明顯影響。本研究中得出共培養中AS濃度對抗性率影響差異顯著，其中以濃度為100 μmol/L最佳。有報道AS 對于河北楊的侵染轉化并沒有促進效果，隨著施加濃度的增加反而還會產生一定的抑制作用。不同研究獲得結果不一致，可能與所選用材料、菌液濃度和菌株的類型有關系。

PCR的高度靈敏極易產生假陽性結果。DNA插入植物基因組后易發生重排，即使載體上的抗性基因或其他基因能表達， 目的基因也未必完整的存在于轉化體中，從而造成檢測結果的假陽性。而且，轉基因植株存在基因沉默等現象，影響外源基因的正常表達，因此，轉基因PCR檢測結果可能不是百分之百準確，所以，除了PCR檢測外，還有必要在DNA水平用點雜交、Southern Blot檢測，在RNA表達水平上用RNA-PCR進行檢測。本文通過轉化葉片進行不同濃度梯度潮霉素的篩選，分化和再生得到了菊苣抗性植株，通過PCR、PCR-Southern和斑點雜交檢測證明了γ-zein基因已經轉化到菊苣基因組中。再通過RT-PCR進一步證明了γ-zein基因已整合到菊苣基因組中，并在轉錄水平上得到了正確表達，并且該轉化方法抗性率高，陽性率也較高，為菊苣以后的遺傳轉化和育種中間材料的創制奠定了基礎。一個完整的轉基因植株的檢測應該包括DNA、RNA方面的檢測，還應該包括該基因表達產物的檢測。本試驗中，γ-zein基因表達的產物主要為含硫氨基酸的蛋氨酸和半胱氨酸，但是由于含硫氨基酸在轉基因菊苣中表達量的檢測，需要一定量的菊苣干樣并打成草粉，因此，該指標只有等到轉基因菊苣單株樣品比較多的情況下才能進行測定。

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通訊作者*Corresponding author.

作者簡介：張玉(1975-)，女，四川仁壽人，博士。E-mail：zhyforage@126.com

基金項目：四川省十二五牧草育種攻關(2011NZ0098-11)，四川省應用基礎項目(2013JY0111)和國家牧草產業技術體系阿壩綜合試驗站資助。

收稿日期：2014-07-07；改回日期：2015-03-10

DOI：10.11686/cyxb2014307http://cyxb.lzu.edu.cn