經皮免疫機制及其在過敏性疾病的應用進展

劉笑純 姚煦

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所過敏與風濕免疫科

·綜述·

經皮免疫機制及其在過敏性疾病的應用進展

劉笑純 姚煦

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所過敏與風濕免疫科

經皮免疫作為一種新型免疫治療途徑，是將抗原和佐劑局部應用于皮膚，誘導機體產生系統性免疫應答的接種方式，該方法安全有效，有望成為具有吸引力的傳統疫苗替代途徑。經皮免疫誘導不同方向免疫反應，但是皮膚免疫耐受方面的具體機制尚未完全明確。大多數研究基于動物模型，動物與人類皮膚存在結構差異，需建立更多研究實現動物模型向人體的轉化。并非所有的疫苗都適用于皮膚接種，研究必須評估其安全性和有效性。各種改良的疫苗遞送系統及其在相關疾病上的臨床應用尚待進一步發掘。

皮膚疾病；過敏反應；免疫；疫苗；治療應用

皮膚富含免疫細胞和免疫分子，具有一套調控精密的免疫網絡。經皮免疫（transcutaneous immunization，TCI）是將抗原和佐劑局部應用于皮膚，誘導機體產生系統性免疫應答的一種新型免疫治療途徑。與傳統針劑注射疫苗相比，TCI疫苗避免了血源性感染，不經過胃腸道降解，作用更為穩定持久，成為新型疫苗發展的趨勢。

一、經皮免疫概況

自20世紀下半葉，皮膚免疫系統的理論逐漸得到關注。1996年，Wang等［1］發現小鼠皮膚表面敷貼卵清蛋白抗原后，血清中檢測到較高水平的特異性IgE和IgG1，誘導機體產生Th2為主的免疫應答。Glenn等［2］發現，霍亂菌素可透過小鼠完整皮膚，引發強烈的免疫反應，闡述了TCI的概念，并證實霍亂毒素同時可作為佐劑應用的可行性。此后數年內，對某些細菌、病毒等抗原、佐劑及相應疫苗遞送系統的研究逐步深入。目前，TCI作為一種新型免疫治療途徑仍處于實驗室研究，針對防治某些感染性疾病和腫瘤設計的疫苗部分已進入臨床試驗階段，主要方向集中在抗原、佐劑和皮膚促滲技術等方面。

二、皮膚免疫系統

皮膚通過精密復雜的免疫網絡抵御外來病原微生物入侵。皮膚主要的免疫細胞包括角質形成細胞（KC）和朗格漢斯細胞（LC），以及成纖維細胞、T 淋巴細胞、樹突細胞（DC）、巨噬細胞、肥大細胞和先天淋巴樣細胞。此外還有多種細胞因子、免疫球蛋白、補體、神經肽等免疫分子［3］，參與構成了皮膚免疫網絡。KC分泌多種細胞因子、趨化因子和抗微生物肽，表面的Toll樣受體是識別病原微生物及其組分的重要物質。LC是表皮特征性DC，特異性表達凝集素受體Langerin。侵入表皮的抗原可被LC識別、攝取和加工，運送至局部引流淋巴結，提呈給初始T細胞啟動免疫應答。腫瘤壞死因子（TNF）α和白細胞介素（IL）1β參與動員LC的遷移，上調整合素α6、CD54、CD86和MHC-Ⅱ類分子的表達，促進LC成熟。表皮屏障結構完整時，LC負責監視外來抗原，維持皮膚免疫耐受。成纖維細胞是真皮的主要成分，可表達Toll樣受體1～10［4］，釋放IL-6、角質細胞生長因子和血管內皮生長因子等，與KC一道參與維持皮膚免疫系統穩態。dDC可在整個真皮層不斷遷移，發揮免疫監視作用。在炎癥早期，dDC從真皮動員至引流淋巴結，可能參與誘導初始T細胞對病原體的免疫應答［3］。不同dDC亞群在促進Th1或Th2反應的作用上有所不同［5-6］，Langerin+dDC參與活化細胞毒性T淋巴細胞，促進Th1反應，抑制Th17細胞分化；Langerin-dDC主要在Th2細胞發育早期發揮作用。

皮膚中的肥大細胞、常駐T細胞以及淋巴結內初始T和B淋巴細胞是主要的免疫效應細胞。真皮中的肥大細胞參與IgE介導的超敏反應，能對多種刺激產生應答，分泌一系列促炎細胞因子和趨化因子，介導T細胞免疫應答方向的極化。初始T和B細胞位于皮膚引流淋巴結，被遷移至局部的抗原提呈細胞激活，在此發生特異性免疫應答。真皮常駐γδT細胞分泌IL-17，可以募集中性粒細胞參與對病原體的先天性防御，并誘導IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子分泌，啟動早期炎癥反應。除此之外，多種細胞因子參與體液或細胞免疫，進一步增強免疫效應。

三、經皮免疫機制

通過皮膚接種是最有效的刺激皮膚歸巢效應T細胞的方式。TCI抗原主要經表皮LC攝取，另外CD14+dDC和能夠交叉提呈的CD141hidDC也參與該過程。LC和dDC攜帶被加工抗原遷移至引流淋巴結，通過MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子提呈給初始CD4+和CD8+T細胞。CD14+dDC優先誘導Th1極化反應，激活CD4+T細胞分化成Th1細胞和濾泡輔助性T細胞。CD141hiDC能將外源性抗原交叉提呈給外周CD8+T細胞，可與LC一道與CD8+T細胞相互作用，誘導其分化為細胞毒性T淋巴細胞，分泌IL-2和IFN-γ，介導細胞免疫。與皮內免疫相比，由于抗原提呈細胞不同亞群的參與，TCI產生的免疫應答更為顯著。表達在樹突細胞表面的內肽酶、外肽酶及血清來源的蛋白酶可以修剪抗原，導致T細胞表位片段缺失，而經皮免疫持續長時的給藥，提供了穩定的表位呈遞，從而補償了蛋白水解造成的表位損失。另外，皮膚中KC、LC［7］、γδT 細胞［8］和肥大細胞［9］等之間復雜的相互作用提高了抗原經皮致敏能力。

Novak等［10］首次提出皮膚的完整性在TCI中的重要性。當皮膚屏障結構完整時，靜息狀態的LC通過樹突在KC間形成網絡，能特異性地選擇并誘導CD4+Foxp3+調節性T細胞活化和增殖［11］，抑制T細胞活化，以維持外周免疫耐受；而當屏障功能受損，外界抗原刺激下，活化的LC誘導病原體特異性效應記憶T細胞和記憶調節性T細胞增殖，限制調節性T細胞活化［12］。皮膚屏障破壞還可激活KC分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎癥細胞因子，促進LC的成熟和遷移，通過啟動類似固有免疫應答的炎癥過程充當佐劑。此外，不完整的皮膚屏障也可誘導抗微生物肽表達升高，參與固有免疫。由此可見，完整的皮膚是誘導耐受的前提。但有研究發現，即使在炎癥刺激下，LC也能夠誘導初始T細胞的免疫耐受，免疫活化絕大多數通過快速遷移的dDC介導［13］。也有實驗表明，在經皮應用抗原后最初發生反應的是dDC而非LC，LC在應答早期呈現無反應狀態［14］。

四、經皮免疫疫苗研究應用

鑒于皮膚中有豐富的不同活性的免疫細胞，根據TCI設計的疫苗具有更高的靶向性，誘導產生的免疫效應更為顯著。與傳統疫苗相比，TCI疫苗是一種安全有效、有望替代傳統針劑注射的新途徑［15］，可用于治療感染性、自身免疫性疾病和腫瘤，也成為過敏原特異性免疫治療的新選擇。

1.經皮給藥系統：TCI疫苗包括各種細菌或病毒的減毒活疫苗、組分疫苗、基因工程疫苗等，另外一些蛋白質、多糖組分或重組DNA技術制備的過敏原也可作為疫苗抗原。一般認為，抗原經皮免疫有胞內滲透、胞間滲透和毛囊滲透3種途徑。角質層具有完整而強大屏障結構，需應用各種遞送系統及佐劑使疫苗易于穿透。疫苗載體可以穩定活化的疫苗，將其靶向至皮膚特定區域，或協同作為佐劑。最初實驗研究常用皮膚貼劑搭載抗原，目前常用的新型疫苗載體有納米顆粒、病毒樣載體、大腸桿菌、囊泡系統、微乳等，其中納米顆粒或微粒由于性質穩定、釋放可控和易被攝取，能有效增強抗原的免疫原性［16］，已被廣泛研究。一些促滲劑（如乙醇、二甲基亞砜、油酸），以及物理促滲技術（如低頻超聲、微針、離子導入、電穿孔、基因槍）的應用，也用于促進經皮傳遞。其他遞送技術，如水凝膠貼劑［17-18］和經毛囊遞送［19-20］逐步顯示其優越性。佐劑的選擇主要根據反應類型的不同，包括ADP核糖基化外毒素、CpG基序、Toll樣受體配體和某些細胞因子等。不同特性的遞送系統誘導不同方向的免疫反應，如激光微孔技術可以誘導Th2反應，而CpG寡脫氧核苷酸作為佐劑能抑制IL-4、IL-5和IL-13的產生，調節免疫反應向Th1方向極化，二者的聯合可以調節Th1/Th2反應之間的平衡［21］。Zaric等［22］利用溶解性聚合物微針陣列載入納米膠囊包裹抗原，特異性靶向皮膚DC網絡，該反應中，LC能交叉激活抗原特異性CD8+T細胞，促進CD4+Th1和Th17細胞分化。不同趨化因子及其受體的差異性表達可以調節LC向引流淋巴結的遷移［23］，通過疫苗載體搭載特定的趨化因子能一定程度上調控免疫效應細胞和分子。

2.TCI疫苗在過敏性疾病中的應用：過敏原特異性免疫治療是唯一能夠阻止過敏性疾病病情進展的具有長期療效的治療途徑［24］，而傳統的皮下免疫方法由于其療程長，過敏原若經針劑入血可能引發全身不良反應，患者依從性不高。皮膚是發生免疫耐受誘導的理想部位，由于皮膚中具有豐富的抗原提呈細胞，TCI疫苗能有效增強療效，縮短療程，減少非特異性反應的發生。有雙盲、安慰劑對照研究表明，經皮過敏原特異性免疫治療能夠顯著改善患者過敏癥狀［25］，治療中過敏原特異性IgG4升高。一項針對兒童季節性過敏性結膜炎的前瞻性研究［26］顯示，每周應用含過敏原的皮膚貼片24 h治療12周后，患兒的過敏癥狀顯著改善，抗組胺藥使用量減少，且未出現局部或全身不良反應。

早在1957年，就有研究者嘗試將過敏原提取物反復應用于破損皮膚來治療花粉和塵螨過敏。有實驗發現，在小鼠正常無損皮膚上外用抗原可以誘導機體產生Th1型細胞因子和IL-10，局部引流淋巴結內CD4+Foxp3+調節性T細胞數量增多，高濃度抗原外用可以有效抑制皮下免疫所誘導的應答反應［27］。與一般TCI疫苗不同，過敏原疫苗需具備針對皮膚DC更高的靶向性，通過佐劑抑制過敏原特異性Th2反應的啟動，減少IL-4和IL-5的產生，增加IFN-γ分泌，誘導Th1反應的極化。既往研究發現，利用膠帶剝離造成小鼠皮膚角質層破壞可以誘導IL-12和IFN-γ的產生，上調MHC-II類分子及LC表面CD11c和CD86、CD40、CD54的表達，有助于過敏原保護性免疫反應的誘導。近年來，應用各種新型皮膚遞送系統優化疫苗設計，減少了非特異性免疫反應的發生。利用激光微孔技術針對變應性哮喘小鼠進行經皮過敏原治療，發現疫苗可誘導IgG2a和Foxp3+CD4+T細胞增多，下調Th1/Th2/Th17反應，顯著抑制相關促炎因子的產生［28］。一種新型納米疫苗載體DermAll［29］，含有特征性表達卵清蛋白的質粒DNA，能減少IL-4和IL-5分泌，阻止過敏原誘導的Th2反應的進展，平衡Th1/Th2反應，有效減輕致敏小鼠過敏癥狀。偶聯碳水化合物的過敏原能特異性靶向至抗原提呈細胞，并通過掩蓋B細胞表位使疫苗分子呈現低變應原性［30］。需注意的是，由于真皮富含肥大細胞，皮膚屏障破壞及高劑量的過敏原可能引起局部瘙癢、紅斑、風團甚至全身過敏等不良反應，但當皮膚貼劑應用次數增加，局部不良反應也隨之減弱，其安全性還需更深入的評估。

五、結語

TCI優于傳統免疫接種方式，具有廣闊的應用前景，對多種疾病特別是過敏性疾病的防治有重要意義。TCI誘導不同方向免疫反應，尤其是皮膚免疫耐受方面的具體機制尚未完全明確。大多數研究基于動物模型，但動物與人類皮膚存在結構差異，需建立更多研究實現動物模型向人體的轉化。并非所有的疫苗都適于皮膚接種，研究中必須評估其安全性和有效性。各種改良的疫苗遞送系統及其在相關疾病上的臨床應用尚待進一步發掘。

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Mechanisms of transcutaneous immunization and its application in allergic diseases

Liu Xiaochun,Yao Xu

Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Transcutaneous immunization（TCI）is a novel immunotherapy approach that induces systemic immune responses via topical application of antigens and adjuvants onto the skin.It is a safe and effective method,and is expected to serve as an attractive alternative to traditional vaccination.TCI induces immune responses in different directions,but the exact mechanism of skin immune tolerance is still unclear.Most studies on TCI are based on animal models.However,there are structural differences between animal skin and human skin,so more researches are needed to achieve the translation of TCI from bench to bedside.Not all vaccines are suitable for cutaneous inoculation,so vaccines for TCI should be evaluated for their safety and efficacy.Various reformed vaccine delivery systems are needed to be further explored in related diseases.

Skin diseases;Anaphylaxis;Immunity;Vaccines;Therapeutic uses

Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com

姚煦，Email：dryao_xu@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.024

國家自然科學基金（81171501、81371735、81573045）；江蘇省自然科學基金（BK20150166）；2014 年亞美醫學基金會（MMAAP）皮膚病項目基金

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171501,81371735,81573045）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK20150166）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014

2015-10-14）

（本文編輯：吳曉初）