高鹽飲食對大鼠大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激及鈉鈣泵活性的影響

劉　嬋　陳　濤　商黔惠

(遵義醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所　心血管病研究所　高血壓研究室，貴州　遵義　563003)

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高鹽飲食對大鼠大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激及鈉鈣泵活性的影響

劉嬋陳濤商黔惠

(遵義醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所心血管病研究所高血壓研究室，貴州遵義563003)

摘要〔〕目的探討長期高鹽飲食對大鼠大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激和Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性及其相關(guān)基因表達的影響。方法雄性Wistar大鼠隨機分為正常鹽對照組(NS組，n=13)、8%高鹽組(HS組，n=24)和8%高鹽+替米沙坦干預(yù)組(HS+Tel組，n=12)，每2 w測量尾動脈壓1次，喂養(yǎng)共24 w。比色法測定大鼠大腦皮質(zhì)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性；用生化酶學(xué)法檢測大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性；通過實時熒光定量PCR法檢測大腦皮質(zhì)NAPDH、Na+-K+-ATPase α1、細胞質(zhì)膜鈣泵(PMCA)1、鈉鈣交換蛋白(NCX)1和NADPH 氧化酶亞單位P22phox mRNA表達。結(jié)果與NS組比較，HS組MDA含量增加、SOD活性減弱(P<0.05)，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性均降低(P<0.05)，NADPH氧化酶亞單位P22phox、Na+-K+-ATPase α1、PMCA1 mRNA表達增加(P<0.05)，NCX1mRNA表達無明顯變化；與HS組比較，HS+Tel組Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性升高(P<0.05)，其他指標無明顯改變。結(jié)論高鹽飲食可引起大鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷及鈉鈣泵活性降低。

關(guān)鍵詞〔〕高鹽飲食；大腦皮質(zhì)；氧化應(yīng)激；鈉鈣泵

第一作者：劉嬋(1985-)，女，碩士，助理研究員，主要從事高鹽飲食致器官損害機制的研究。

高鹽攝入不僅導(dǎo)致高血壓發(fā)生，而且可造成腦卒中、冠心病發(fā)病危險增加〔1〕。然而鹽對心腦血管疾病的致病機制至今仍不清楚。有文獻〔2～4〕報道高鹽攝入可引起大鼠心、腎臟、主動脈和大腦腦血管氧化應(yīng)激功能紊亂，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶表達增高和超氧化物歧化酶(SOD)表達減少。腎素-血管緊張素系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)及細胞膜鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運功能異常參與鹽敏感的發(fā)病機制〔5〕。離子泵參與細胞膜結(jié)構(gòu)的維持和細胞膜離子轉(zhuǎn)運，特別是細胞膜Na+、K+和Ca2+的轉(zhuǎn)運。大量研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜結(jié)構(gòu)及功能改變導(dǎo)致的離子轉(zhuǎn)運缺陷與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常可能是高血壓(尤其是鹽敏感性高血壓)的發(fā)病機制之一，而腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)是和鹽敏感性有密切關(guān)系的2 個主要器官和系統(tǒng)〔6〕。本實驗擬探索慢性高鹽負荷下大鼠大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激水平與離子泵功能的變化。

1材料與方法

1.1主要材料Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性檢測試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)。引物根據(jù)相應(yīng)cDNA序列設(shè)計，由TaKaRa生物工程公司合成。見表1。

表1　各目的基因引物序列及擴增片段長度

1.2方法

1.2.1模型的建立及分組Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常鹽對照組(NS組)13只，8%高鹽組(HS組)24只，8%高鹽+替米沙坦干預(yù)組(HS+Tel組)13只。NS組飼以正常鹽飼料(0.5%NaCl)，HS組飼以8%高鹽飼料，HS+Tel組飼以8%高鹽飼料，同時給予替米沙坦灌胃，替米沙坦起始劑量2 mg/kg，隨后根據(jù)血壓情況每2 w調(diào)整1次劑量，最大劑量至40 mg/kg，使血壓盡量控制在正常范圍內(nèi)。各組大鼠均在相同標準環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲用自來水，飼養(yǎng)24 w。

1.2.2血壓測定用無創(chuàng)測壓儀測量大鼠尾動脈壓，每只大鼠測量3次，取其平均值，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始測壓，作為基礎(chǔ)壓，隨后每2 w測量1次，實驗結(jié)束后測定大鼠頸總動脈壓。根據(jù)實驗終末尾動脈壓與基礎(chǔ)壓的比較及頸動脈壓水平，將HS組分為高鹽高血壓組(HS-HBP組)12只和高鹽正常血壓組(HS-NBP組)12只，共飼養(yǎng)24 w，高血壓大鼠判定標準：處理后血壓增加20～30 mmHg并>120 mmHg。

1.2.3氧化應(yīng)激損傷指標測定24 w后將大鼠斷頭處死，在低溫冰盤上取出分離大腦皮質(zhì)，制作10%的組織勻漿，按照南京建成生物工程公司試劑盒說明書方法步驟測定，用紫外分光光度計檢測MDA含量和SOD酶活性。

1.2.4大腦皮質(zhì)離子泵活性檢測離子泵(ATP酶)活性用酶學(xué)比色法測定，其活性以每毫克總蛋白中ATP酶每小時分解ATP產(chǎn)生磷的量表示(μmol·h-1·mg-1)。

1.2.5大腦皮質(zhì)離子泵相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR用Trizol 試劑提取大鼠大腦皮質(zhì)總RNA，隨后按QiagenRNeasyMini Kit 說明書對RNA進行純化，紫外分光光度計測定樣本在260 nm和280 nm的吸光度值(A260和A280)，所得A260/A280在1.80～2.20之間認為純度符合要求，配置40 μl 50 mg/L RNA逆轉(zhuǎn)錄液，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR反應(yīng)，結(jié)果以目的基因/β-actin的比值進行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件兩兩比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，方差齊使用LSD法，方差不齊使用TamhaneT2法。

2結(jié)果

2.1各組大鼠大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激損傷比較與NS組比較，HS-HBP組、HS-NBP組MDA水平明顯增高，SOD水平明顯降低，HS+Tel組MDA水平增高(P<0.05)；與高鹽組比較，HS+Tel組MDA含量、SOD活性無明顯差異。見表1。

表1　各組大鼠大腦皮質(zhì)SOD活性、MDA含量比較

與NS組比較：1)P<0.05

2.2各組大鼠大腦皮質(zhì)NAPDH氧化酶亞單位P22phox基因表達比較與NS組(100±13)比較，HS-HBP組NAPDH氧化酶亞單位P22phox基因水平(155±14)明顯增高(P<0.05)，其他各組間無明顯差異(HS-NBP組：99±10，HS+Tel組：90±10)。

2.3各組大鼠大腦皮質(zhì)離子泵活性比較與NS組比較，HS-HBP組、HS-NBP組大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase活性明顯降低(P<0.05)；與高鹽組比較，HS-Tel組Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase活性均明顯增加。見表2。

2.4各組大鼠大腦皮質(zhì)離子泵相關(guān)基因表達比較表3可見，與NS組比較，HS-HBP組、HS-NBP組大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPaseα1、PMCA1基因表達明顯增加(P<0.05)；與HS組比較，HS+Tel組Na+-K+-ATPaseα1、PMCA1基因表達均無明顯差異；大腦皮質(zhì)NCX1基因表達各組間無明顯差異。

表2　各組大鼠大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase

與NS組比較：1)P<0.05；與HS-HBP組比較：2)P<0.05；與HS-NBP比較：3)P<0.05；下表同

表3　各組大鼠大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPaseα1，PMCA1和

3討論

鈉泵是由 α 、β和γ亞單位組成的多聚體，其中α亞單位為催化亞單位，其構(gòu)型決定鈉泵的活性，是鈉泵的功能單位。α亞單位又有4種異構(gòu)體：α1 、α2 、α3 和α4 。目前認為高鹽攝入引起Ca2+超載的調(diào)控機制是高鹽攝入引起哇巴因等增加，抑制鈉泵活性，使胞內(nèi)Na+增加，激活Na+-Ca2+交換蛋白(NCX1)反向轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致Ca2+升高〔11〕。前期研究表明：高血壓患者的淋巴細胞及有高血壓家族史子代的臍動脈血管平滑肌細胞(VSMC)和高血壓大鼠VSMC質(zhì)膜鈉泵和鈣泵活性降低、Ca2+增加；VSMC自分泌血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)增加，Ang Ⅱ抑制VSMC兩種離子泵活性及其mRNA(鈉泵α1、β1亞單位和PMCA亞型1(PMCA1)表達，Ang Ⅱ阻斷劑上調(diào)VSMC兩種離子泵活性及其mRNA表達〔14～16〕。Pulina等〔17〕發(fā)現(xiàn)哇巴因顯著上調(diào)SD大鼠主動脈和腸系膜動脈VSMC鈉泵α2亞單位。鈉泵α2基因敲出小鼠血管張力增加、NCX1抑制劑阻斷該效應(yīng)并降低鹽依賴高血壓大鼠的血壓，PMCA亞型(PMCA)4過表達能降低主動脈縮窄和AngⅡ灌注導(dǎo)致的Ca2+超載、心肌肥厚和纖維化〔18〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，高鹽可使大鼠大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPaseα1，PMCA1 mRNA表達增加，而大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性卻下降，推測在大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATPase α1，PMCA1可能不是決定Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的催化亞單位。

近年研究顯示高鹽使循環(huán)RAS抑制、組織局部RAS激活，高鹽飲食誘導(dǎo)高血壓大鼠心血管及腎臟AngⅡ1型(AT1)受體mRNA和密度增加、膠原沉積，AT1受體阻斷劑(ARB)替米沙坦能減輕高鹽飲食誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠靶器官損害〔19〕。Kagiyama等〔20〕最近發(fā)現(xiàn)在AT1受體α亞型(AT1αR)基因敲除小鼠，高鹽和醛固酮仍能誘導(dǎo)心肌間質(zhì)和心肌內(nèi)動脈周圍纖維化，而細胞膜NCX和Na+-K+-ATPaseα2亞單位mRNA表達降低，說明高鹽和醛固酮誘導(dǎo)心肌纖維化的機制至少部分不依賴Ang Ⅱ和AT1aR，可能還涉及NCX和Na+-K+-ATPase介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。本實驗結(jié)果顯示替米沙坦對長期高鹽飲食飼養(yǎng)Wistar大鼠的大腦皮質(zhì)保護作用可能與減少腦細胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度有關(guān)。

綜上所述，長期高鹽飲食飼養(yǎng)誘導(dǎo)Wistar 大鼠大腦皮質(zhì)損傷與持續(xù)的高氧化應(yīng)激水平和Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性降低有關(guān)，替米沙坦可能通過增加鈉鈣泵活性對大腦皮質(zhì)起保護作用。

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〔2015-01-15修回〕

(編輯袁左鳴)

Effects of high salt diet on oxidative stress and Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities in cerebral cortex of Wistar rats

LIU Chan，CHEN Tao，SHANG Qian-Hui.

Institute of Clinical Medicine, Institute of Cardiovascular Disease and Hypertension Research Lab,Department of Cardiology of Affiliated Hospital, Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of high salt diet on oxidative stress and Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities and the mRNA expression in cerebral cortex of Wistar rats.MethodsWistar rats were divided into normal salt control(NS)(n=13),high salt(8%) model(HS, n=24) and high salt+telmisartan(HS+Tel) groups(n=12). Tail-cuff artery pressure was determined every 2 weeks. Values of SOD activity and MDA content were determined by colorimetry. The activities and mRNA levels of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in cerebral cortex were determined by enzyme colorimetry and real-time polymerase chain reaction(PCR),respectively.ResultsCompared with those of NS group, activity of SOD was decreased and MDA content was increased. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were significantly reduced, whereas the mRNA expressions of NAPDH, Na+-K+-ATPase α1 subunit and PMCA1 were increased. After treated with telmisartan, the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase became much higher compared with those of HS group.ConclusionsLong-term high-salt diet could lead to oxidative stress and down-regulat activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in cerebral cortex.

【Key words】High-salt diet; Cerebral cortex; Oxidative stress; Na+-pump;Ca2+-pump

通訊作者：商黔惠(1960-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事高血壓及其靶器官損害的機制和防治研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81160041)；貴州省社會發(fā)展攻關(guān)計劃項目〔黔科合SY字(2011)3047號〕;貴州省高層次人才科研條件特助項目(TZJF-2009年-42)

中圖分類號〔〕R74〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6027-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.011