高通量測序技術及其發展

陳怡河南師范大學

高通量測序技術及其發展

陳怡
河南師范大學

摘要：高通量測序技術是DNA測序的革命性技術創新，具有同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序和一般的讀長較短的功能。速度快、準確率高、成本低，實現了對物種基因組或轉錄組的深入研究。該文詳細介紹了高通量測序技術的種類和測序原理，以及各種測序平臺的發展進程和優缺點。

關鍵詞：高通量測序技術；454焦磷酸測序；Solexa測序；SOL?ID測序；第三代測序技術

自1975年Frederick Sanger和Walter Gilbert創建DNA測序技術以來，DNA測序飛躍發展，成為分子生物學及臨床醫學等領域的重要研究技術。Sanger測序法在測序量和微量化等方面具有一定的局限性。高通量測序與單分子測序技術相繼涌現，為大規模測序提供了技術支持。

1　高通量測序技術

高通量測序技術運行數據量大，可以同時對數百萬個DNA分子實施序列檢測。高通量測序平臺主要包括Roche公司/454焦磷酸測序、Illumina公司/Solexa聚合酶合成測序及ABI公司/SOLID連接酶測序。

以Roche/454焦磷酸測序為例，該技術的檢測原理為，第一步把DNA單鏈運用PCR進行擴增與引物雜交，雜交后產物與ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、熒光素酶及5’磷酸硫腺苷一起反應孵育。此過程中dNTP會依次加入到引物上。加入的dNTP若與模板配對便釋放相同數量的焦磷酸基團。ATP硫酸化酶催化焦磷酸基團生成ATP，ATP驅動熒光素酶催化熒光素向氧化熒光素轉化并發出與ATP含量成線性關系的可見光信號。之后ATP與未反應的dNTP及時被降解。再生的反應體系進入到下一種dNTP循環，根據所得信號峰值圖可獲得DNA序列信號。此技術讀取長度最長，但通量最低。當測序遇到多聚核苷酸時（如AAAAAA）時，堿基個數與熒光信號強度不再成線性關系，所以在檢測具有重復序列的DNA片段時具有困難。454焦磷酸測序法常用的平臺為GS FLX Titanium sequencing Kit XL+。

Solexa聚合酶合成測序技術讀取的片段多，測序通量高，高度自動化，適合大量小片段DNA的測序。但可逆反應時隨反應次數的增加效率降低、信號減弱，且讀長短，從頭測序具有困難。該技術廣泛應用的測序平臺為MiSeq。

SOLiD連接酶測序每個堿基讀取兩次，準確性較高，特別是針對SNP的檢測，適合檢測參考基因序列。在三種測序技術中，該技術測序讀長為50bp最短，讀取長度受反應次數限制。ABI 3730 XL等測序平臺被廣泛應用。

2　第三代代測序技術

第三代測序技術指Pacific Bioscience公司的單分子實時測序技術（SMRT），Helico BioScience公司單分子測序技術（TIRM），以及Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術。新一代測序技術達到長讀取長度、高通量、低成本的目的。不同于第二代測序，第三代分子測序不需進行PCR擴增，DNA模板與固體表面結合后邊合成邊測序。

2.1Pacific Bioscience SMRT技術

Pacific Bioscience公司的SMRT技術基于邊合成邊測序的原理，采用Zero-ModeWaveguide（ZMW零級波導）。測序過程為：被熒光標記的核苷酸與模板鏈結合在聚合酶活性位點上（每種脫氧核苷酸由不同顏色染料標記），激發出不同熒光，在熒光脈沖結束后，被標記的磷酸集團被切割釋放，聚合酶轉移到下一個位點，下一個脫氧核苷酸連接到位點上進行熒光脈沖，進入下一測序過程。

2.2Helico BioScience TIRM技術

Helico BioScience公司的基于全內反射顯微鏡的測序技術——單分子測序技術（TIRM）同樣利用邊合成邊測序的原理，隨機打斷待測序列成小分子片段，用末端轉移酶在小片段的3’末端添加poly(A)，在poly(A)末端實施阻斷及熒光標記，將小片段與帶有poly(T)的平板雜交，加入聚合酶和被熒光標記的脫氧核苷酸進行DNA合成，每循環一次加入一種dNTP，之后洗脫去除未合成的DNA聚合酶和dNTP，對Cy3成像，檢測模板位點上的熒光信號，對核苷酸上的染料裂解釋放，加入下一種dNTP和聚合酶，進行下一輪循環。

2.3Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術

納米孔測序技術的原理不同與前兩種技術，DNA分子或其堿基從孔洞經過時會影響固有光信號和電流。OxfordNanopore納米孔單分子測序技術采用α—溶血素構建孔洞，核酸外切酶黏附在孔洞外表面，傳感器（環糊精）結合到孔洞的內表面。之后脂雙分子層包裹納米孔。脂雙分子層兩側為不同鹽濃度，并提供合適的物理條件。在合適電壓下，核酸外切酶催化斷裂DNA單鏈，堿基進入納米孔中，與孔內的環糊精反應，影響流過納米孔的固有電流，每個堿基都能產生特定電流，運用該方法可將不同堿基區分開來。

3　高通量測序技術的展望

近年間，高通量測序被廣泛應用到各領域，新一代測序技術也取得突飛猛進的進展，但后續的海量測序數據分析，以及如何以生物知識去解釋和應用都存在問題。但總體上，新一代測序技術的費用已大大降低，具有精確度高、速度快、敏感性強等顯著特點。隨著高通量測序技術的飛躍發展，相信在不久的將來，測序技術會在生物、醫學等領域發揮更加重要的作用。

參考文獻：

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[3]劉莉揚,張學工.高通量測序技術在臨床醫學中的應用進展[J].醫學綜述,2013,19(16):2971-2973.

作者簡介：陳怡（1995-），女，漢，本科，河南省永城人，河南師范大學生命科學學院。