結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α的表達(dá)及意義

姜晗，何巍，于安石，劉放

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科,遼寧沈陽(yáng)110024)

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結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α的表達(dá)及意義

姜晗，何巍，于安石，劉放

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科,遼寧沈陽(yáng)110024)

摘要目的：研究P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與結(jié)腸癌臨床指標(biāo)的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學(xué)S-P染色方法檢測(cè)P16、CyclinD1和PKC-α在70例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果：結(jié)腸癌組織中P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，CyclinD1和PKC-α陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：結(jié)腸癌的發(fā)生與CyclinD1、PKC-α高表達(dá)和P16低表達(dá)均有關(guān)，P16蛋白可作為結(jié)腸癌早期診斷、臨床生物學(xué)行為和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌；P16；CyclinD1；PKC-α

結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第3位[1],臨床上早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷，準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后至關(guān)重要，及時(shí)有效的治療，可以提高患者的生存率，改善預(yù)后，發(fā)現(xiàn)高度敏感、高度特異的相應(yīng)標(biāo)志物，對(duì)于挽救結(jié)腸癌患者生命，降低其死亡率尤為重要。P16是目前發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)直接抑制惡性腫瘤發(fā)生的基因蛋白[2]。其蛋白產(chǎn)物是細(xì)胞周期G1期到S期的調(diào)節(jié)蛋白,多數(shù)消化道惡性腫瘤組織中細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)頻發(fā)過(guò)度表達(dá)[3]。蛋白激酶C-α(PKC-α)是一類(lèi)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增殖調(diào)控和腫瘤發(fā)生中具有重要作用的絲/蘇氨酸蛋白激酶[4]。充分臨床研究數(shù)據(jù)證明消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與P16、CyclinD1和PKC-α關(guān)系密切。本研究利用免疫組化法檢測(cè)P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，了解三者與結(jié)腸癌的關(guān)系，進(jìn)而揭示其對(duì)結(jié)腸惡性腫瘤發(fā)病病因的意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料搜集沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院普外科、消化科送檢病理教研室的2015年1月至7月術(shù)后結(jié)腸癌和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本70例。其中男性患者37例，女性患者33例，年齡35～84歲，平均年齡為61歲。高分化33例，中分化21例，低分化17例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。Duke’s分期：A期3例；B1期14例，B2期12例；C1期19例，C2期19例；D期3例(肝臟轉(zhuǎn)移)。

主要儀器：光學(xué)顯微鏡，石蠟切片機(jī)，染色缸，冰瓶高壓鍋等。

主要試劑：鼠抗人P16、鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自北京中山生物制品有限公司，兔抗人PKC-α購(gòu)自武漢博士德公司。

所有患者術(shù)前均未行放療和化療。標(biāo)本均用 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，所有組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法常規(guī)免疫組織化學(xué)S-P染色方法，CyclinD1經(jīng)微波抗原修復(fù)；P16、CyclinD1和PKC-α抗體的免疫產(chǎn)物均用過(guò)氧化物酶-DAB顯色，抗體效價(jià)分別為1∶40、1∶50、1∶50；免疫組化陰性對(duì)照采用一抗為PBS替代，陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒提供的人結(jié)腸癌對(duì)照片。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)P16陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核，CyclinD1陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞核，PKC-α陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核，以細(xì)胞中相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。參照Fromowitz方法，在高倍鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)如下評(píng)分：(1)無(wú)著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3[5]；(2)陽(yáng)性范圍：< 5%為0，5% ～25 %為1，26%～50% 為2，51%～70%為3，>70%為4[6]。兩項(xiàng)結(jié)果相加<2為陰性(-)，2～3為弱陽(yáng)性(+)，4～5為中度陽(yáng)性(++)，6～7為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1P16在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系結(jié)腸癌組織中P16陽(yáng)性表達(dá)率為41.4%(29/70),明顯低于癌旁組織[65.7%(46/70)]，并與Duke’s分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P﹤0.05)。見(jiàn)表1。

表1　P16在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.2CyclinD1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系CyclinD1在結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為62.9%(44/70)，明顯高于癌旁組織[47.1%(33/70)]，在Duke’s分期高、分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中CyclinD1表達(dá)明顯升高(P﹤0.05)。見(jiàn)表2。

表2　CyclinD1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系結(jié)腸癌組織中PKC-α陽(yáng)性表達(dá)率為65.7%(46/70)，明顯高于癌旁組織[38.5%(27/70)]，并隨著Duke’s分期高和分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.4結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α表達(dá)的相關(guān)性對(duì)結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性的分析，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CyclinD1和PKC-α具有明顯的正相關(guān)性；P16和CyclinD1及PKC-α之間，均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.5P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的病理結(jié)果P16、CyclinD1及PKC-α的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1　中分化結(jié)腸癌組織中P16表達(dá)(免疫組化染色×400)P16陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核

圖2　中分化結(jié)腸癌組織中CyclinD1表達(dá)(免疫組化染色×400) CyclinD1陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞核

圖3　中分化結(jié)腸癌組織中PKC-α表達(dá)(免疫組化染色×400)PKC-α陽(yáng)性主要表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核

3討論

人體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)依賴(lài)于細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的平衡調(diào)控，任何一種調(diào)控因子發(fā)生紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖 ，從而誘發(fā)腫瘤[8]。已經(jīng)證實(shí)，結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程涉及到多種基因的調(diào)控，細(xì)胞周期過(guò)程中癌基因蛋白的激活與抑癌基因蛋白的失活等是造成細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)化的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，P16、CyclinD1及PKC-α均為重要的細(xì)胞周期蛋白，任何因素導(dǎo)致這些蛋白異常表達(dá)時(shí)，引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和惡性演進(jìn)[9]。

本研究可見(jiàn)，結(jié)腸癌組織中P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，臨床分期A、B期高于臨床分期C、D期；在高分化組陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中低分化組；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。由此提示，結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展與P16蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸癌組織分化程度、Duke’s分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與P16蛋白表達(dá)密切相關(guān)。它是直接作用于細(xì)胞周期的抑癌因子，將細(xì)胞周期控制和癌基因兩個(gè)曾經(jīng)獨(dú)立的研究領(lǐng)域連接在一起，有可能成為癌癥基因治療的新方向。可考慮將P16蛋白作為判斷結(jié)腸癌惡性程度的一個(gè)臨床指標(biāo)。CyclinD1、PKC-α在結(jié)腸癌中的過(guò)度表達(dá)，與結(jié)腸癌的分化程度、轉(zhuǎn)移相關(guān)。二者隨分化程度的降低、臨床分期越高、轉(zhuǎn)移的發(fā)生而出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中CyclinD1、PKC-α過(guò)表達(dá)關(guān)系密切。通過(guò)檢測(cè)CyclinD1、PKC-α變化，可以幫助判斷臨床結(jié)腸惡性腫瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移及惡性度、判斷預(yù)后有著極其重要意義，為臨床結(jié)腸癌治療和評(píng)估預(yù)后提供有力幫助。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了免疫組織化學(xué)S-P染色方法研究了P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)及其意義。CyclinD1和PKC-α明顯相關(guān)，P16和CyclinD1及PKC-α之間均無(wú)明顯相關(guān)。P16蛋白的表達(dá)下降及CyclinD1和PKC-α蛋白的過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖為結(jié)腸癌的生物學(xué)行為的指標(biāo)，為幫助臨床結(jié)腸癌患者的治療及進(jìn)一步評(píng)估結(jié)腸癌患者的預(yù)后，進(jìn)而采用更加有效的治療措施有著重大意義。由于本實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)條件的限制，無(wú)法進(jìn)一步從基因水平研究它們的作用機(jī)制，待今后條件允許后進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]張亞軍，滕寶群，周好，等.Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子在結(jié)腸癌中的表達(dá)并與腫瘤分期的相關(guān)性[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2013,33(2):123-126.

[2]蔡珂， 倪世昌，蔣三亞.Bmi-1、P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2011,9(21):102-103.

[3]肖忠盛，王松， 梁慶模.奧曲肽對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞Wnt通路β-catenin/TCF及下游靶基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)腫瘤外科雜志，2013,12(6):366-370.

[4]王建紅，王立生，朱惠明，等.蛋白激酶C在雙歧桿菌預(yù)防大腸癌生長(zhǎng)中的作用[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2004,16(2):65-66.

[5]Fukuyo Y,Takahashi A,Hara E,et al.E2FBP1 antagonizes the p16INK4A-Rb tumor suppressor machinery for growth suppression and cellular senescence by regulating promyelocytic leukemia protein stability[J].Oral Sci,2011，3(4):200-208.

[6]XU LF,Ni JY,Sun HL,et al.Effects of hypoxia-inducible factor-1α silencing on the proliferation of CBRH-7919 hepatoma cells [J].World Gastroenterol,2013,19(11):1749-1759.

[7]Tao LL, Lei Y, Wang G L,l et al.Effect of extracts from Radix Ginseng, Radix Notoginseng and Rhizoma Chuanxiong on delaying aging of vascular smooth muscle cells in agedrats[J]．Chin J Integr Med,2012,18(8):582-590.

[8]Ke Q,Yang RN,Ye F,et al.Impairment of liver regeneration by the histone deacetylase inhibitor valproic acid in mice [J].Zhejiang Univ-Sci B,2012,13(9):695-706.

[9]孟慶凱，張菁茹，王輝.p16基因克隆及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長(zhǎng)的抑制作用 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版) 2011，31(6)：744-747.

Expression of P16,CyclinD1 and PKC-α in Colon Carcinoma Tissue and Its Significance

JIANG Han,HE Wei,YU Anshi,LIU Fang

(Departrent of Gastroenterology,The Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College,Shenyang 110024，China)

AbstractObjective:To study the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in colon caranoma tissues, and the their relationships with clinical index of colon carcinoma.Method:S-P immunohistochemical staining was used to detect the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in 70 case of colon carcinoma tissues and adjacent tissues.Results:Possitive rate of P16 protein expression in colon carcinoma tissue was obviously lower than that in adjacent tissue，positive rate of CyclinD1 and PKC-α expressions were obviuosly higher than that in adjacent tissues.There were significant differences.Conclusions:The occurrence of the colon carcinoma has relation with high expressions of CyclinD1 and PKC-α, and the low expression of P16.P16 protein can be used as the important index of early diagnosis of colon carcinoma, clinical biological behavior and prognostic evaluation.

Key wordscolon carcinoma；P16；CyclinD1；PKC-α

收稿日期2015-07-19

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.007

中圖分類(lèi)號(hào)R135.35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1008-2344(2015)04-0215-03

作者簡(jiǎn)介姜晗(1979—)，男(漢)，主治醫(yī)師，研究方向：臨床腫瘤病理學(xué).E-mail:jianghan2002@163.com

基金項(xiàng)目沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目(No.20142047)