PCR反應常見問題及對策分析

王英 鄧永強 張代 芬邢坤 （四川省動物疫病預防控制中心 610041）

PCR反應常見問題及對策分析

王英 鄧永強 張代 芬邢坤 （四川省動物疫病預防控制中心 610041）

PCR是快速擴增DNA的一種方式，可檢測到劑量非常低的DNA分子，常用于動物疫病病原的快速檢測。文中對PCR反應中常見問題及原因逐一分析，以提高PCR反應的準確性，科學指導動物疫病診斷。

PCR；常見問題；對策

PCR全稱聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction）， 1983 年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法[1]。PCR是體外快速擴增DNA的一種方式，主要在高溫下變性、低溫退火、適合溫度下延伸等步驟循環進行，使DNA迅速擴增。

PCR反應特異性強、靈敏度高、簡便，可快速體外檢測微量DNA，是各級獸醫實驗室快速檢測和診斷的常用技術，檢測結果的準確性直接關系動物疫病的診斷和診治效果。現將PCR反應中常見的問題及原因匯總分析如下，以提高PCR在臨床診斷中準確性，科學指導動物疫病診斷。

1 假陽性

1.1 引物不合適

靶序列太短或引物太短易出現假陽性。引物特異性不強，即能擴增出目的序列，也能擴增出非目的性序列，導致假陽性。需要重新設計特異性強的引物。

1.2 氣溶膠污染

空氣與液體面摩擦，操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋或吸樣時移液槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而導致污染。操作時要輕柔，避免氣溶膠的產生。

1.3 儀器污染

離心管密封不嚴導致反應液在操作過程中附著在離心機、PCR反應儀等儀器上，或由于移液槍使用不當，樣本吸附在移液槍內壁導致交叉污染。定期清理離心機、PCR反應儀，減少交叉污染。移液槍應專用，如只用于加樣或提取DNA等。

1.4 操作不規范

由于操作不當，陽性對照DNA混入檢測樣本中從而出現假陽性擴增。操作時應小心輕柔，防止陽性對照DNA吸入加樣槍內或濺出離心管外。加樣時應先加陰性對照樣品，再加待檢樣品，最后再加陽性對照樣品。

1.5 器材污染

PCR反應應用的所有器材包括槍頭、離心管等均應高壓消毒，離心管和槍頭等應一次性使用。吸取不同樣本時要及時更換槍頭，必要時，反應管和試劑用紫外線照射以破壞存在的核酸。實驗操作要考慮分區試驗，如設立DNA提取室、擴增室等。

2 假陰性

2.1 DNA模板純度不佳

在提取模板的過程中，操作不當導致模板丟失過多、雜蛋白質高，或制備的模板中含有PCR反應抑制劑[2]都會影響PCR的擴增效率。重新提取DNA模板。

2.2 變性不完全

變性溫度低或時長不足導致模板DNA變性不徹底，最終擴增失敗。提高變性溫度，延長變性反應時間。

3 反應條帶弱

3.1 DNA模板量太少

組織樣本中DNA含量低，所以提取出的DNA濃度低，導致反應條帶弱。增加DNA模板量，確保DNA模板干凈。

3.2 引物量不足

引物過少導致PCR反應效率低。在PCR反應中，引物濃度一般為0.1～0.5umol/L[3]。增加引物量。

3.3 變性時間過長

變性時間過長導致DNA聚合酶失活。注意減少變性時間。

3.4 退火溫度過高

退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。以2℃為梯度設計梯度優化退火溫度。

3.5 延伸時間太短

堿基沒有充分的時間進行配對延伸導致擴增效率低。以5s為梯度優化延伸時間。

3.6 PCR循環數不足

適當增加循環次數，提升PCR擴增效率。

4 出現非特異性擴增帶

4.1 DNA模板量過多

稀釋模板后重新進行PCR反應。

4.2 引物特異性不強或濃度偏高

引物與靶序列不完全互補或聚合形成二聚體導致非特異性擴增過多，濃度偏高則會引起錯配和非特異性擴增[1]。重新設計特異性強的引物，同時降低引物濃度。

4.3 Tap聚合酶量過多

減少DNA聚合酶的使用量。

4.4 Mg2+離子濃度過高

M早2+濃度過高可降低PCR反應的特異性。注意降低M早2+濃度。

4.5 dNTP濃度過高

減少dNTP的使用量。

4.6 退火溫度過低

提高退火溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。以2℃為梯度優化退火溫度。

4.7 PCR循環次數過多

減少反應循環數。

5 PCR擴增產物拖尾

5.1 模板純度不佳

提取的模板中雜蛋白含量高而導致擴增產物有拖尾現象。重新制備純度高的DNA模板，嚴格操作，減少模板中雜蛋白含量。

5.2 緩沖液不合適

緩沖液的加入有助于酶的穩定。更換緩沖液。

6 條帶大小與理論值不符

6.1 模板或引物使用錯誤

重新配制反應體系，確保加入正確的模板和引物。

6.2 污染

環境污染、氣溶膠污染和儀器污染都會影響PCR反應的特異性。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行徹底清潔后重新進行PCR反應。

7 陽性對照無條帶

7.1 DNA模板量太少

增加DNA模板量，并確保DNA模板干凈。

7.2 延伸溫度過高

不利于引物和模板的結合。以2℃為梯度優化延伸溫度。

7.3 變性溫度與時間

變性溫度低，樣本DNA解鏈不完全導致PCR反應失敗。提高變性溫度和反應時間。

7.4 退火溫度不合適

以2℃為梯度優化退火溫度。

7.5 延伸時間過短

延伸反應的時間可根據擴增片段的長度而定，一般1kb以內延伸1min[1]。以5s為梯度優化延伸時間。

8 陰性對照出現條帶

8.1 儀器污染

PCR反應儀、工作臺、試劑和槍頭有污染。使用全新的試劑，槍頭要高壓滅菌，對反應儀器和工作臺進行徹底清潔。

8.2 氣溶膠污染

空氣中的氣溶膠進入反應管導致陰性對照出現條帶。

9 檢測重復性不佳

9.1 加樣不準確

加入的試劑或模板量不均一導致PCR反應結果不一致。

9.2 儀器硬件因素

更換了反應管或PCR反應儀導致PCR反應結果不一致。

[1]魏群.分子生物學實驗指導.北京:高等教育出版社;海德堡:施普林格出版社,1999.12.

[2]現代分子生物學實驗技術[M].高等教育出版社,1993.

[3]PCR檢驗技術[M].四川大學出版社,1995.

文中有些資料摘自Internet網站，資料中未列出作者，在此向作者表示感謝！

王英，女，黑龍江省雞西市人，碩士，獸醫師，現從事動物疫病防控工作。