多烯磷脂酰膽堿對樹突狀細胞的抑制作用研究

潘偉 郝文婷 李向陽 徐慧雯 孫芬芬

·實驗研究·

多烯磷脂酰膽堿對樹突狀細胞的抑制作用研究

潘偉 郝文婷 李向陽 徐慧雯 孫芬芬

目的研究多烯磷脂酰膽堿(PPC)對樹突狀細胞(DC)表型分化及分泌炎癥因子的影響,探討PPC抗炎作用。方法8只SPF紋雌性Balb/c小鼠,隨機分為四組,每組2只。運用免疫磁珠分析小鼠脾臟DC,分別加入PPC(PPC組,2只)、脂多糖(LPS,LPS組,2只)、PPC+LPS(PPC+LPS組,2只)以及磷酸鹽緩沖液(PBS,PBS組,2只)進行刺激。24 h后收集細胞及培養上清,流式細胞術檢測DC表面活化分子表達情況,流式微珠陣列法(CBA)檢測細胞因子分泌情況。結果PPC組DC表面CD40、CD80、CD86、主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅱ分別為(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS組的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且顯著低于LPS組的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)；PPC+LPS組CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,顯著低于LPS組(P<0.01)。PPC組和PPC+LPS組白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)顯著低于LPS組(P<0.01)。PPC+LPS組單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平明顯低于LPS組(P<0.01)。結論PPC可通過抑制DC活化及炎癥因子釋放,發揮抗炎效果。

多烯磷脂酰膽堿；樹突狀細胞；細胞表型；炎癥因子

磷脂酰膽堿(PC)又稱為卵磷脂,由磷脂酰基與膽堿的羥基酯化形成,具有護肝［1,2］、健腦、美容等功效。近年來發現其對機體炎癥反應的調節作用已在腸炎、類風濕性關節炎［1］模型中證實,PC可以抑制TNF-α、IL-6等促炎因子釋放,促進IL-10等抗炎因子分泌,從而緩解病情。DC是目前已知的最有效的專職抗原提呈細胞,貫穿于炎癥反應發生發展過程中。成熟的DC表達高水平MHC-Ⅱ以及協同刺激分子,可分泌多種細胞因子,調節Th細胞分化；也可將抗原遞呈給T細胞并使之活化,啟動機體的初次免疫應答。那么PC是否通過抑制DC成熟以及炎癥因子釋放,下調機體炎癥反應,目前尚不清楚。本文以PC衍生物——PPC為研究對象,明確其對DC的體外抑制作用,為闡明PC的抗炎機制提供見解。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠8只,體重18～22 g,購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司。8只小鼠隨機分為四組,每組2只。

1.1.2 實驗試劑 青霉素、鏈霉素為美國GIBCO公司產品；PPC注射液購自賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司；Mouse inflammation kit及 Cytometric bead array mouse/rat soluble protein master buffer kit,為美國BD公司產品；抗小鼠 FITC-CD11c、PerCP-Cy5.5-CD80、PE-Cy7-CD86、PECD40、APC-MHC-Ⅱ及其同型對照,流式染色緩沖液,為美國eBioscience公司產品；Mouse CD11c microbeads,為德國Miltenyi公司產品。

1.1.3 主要儀器 離心機購自德國Eppendorf公司及美國Beckman公司；FACSCanto Ⅱ流式儀及FCAP 3.0軟件購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC分離及刺激 剖殺Balb/c小鼠,無菌取脾臟,制備單細胞懸液,采用CD11c分離試劑盒陽性分選DC細胞,流式細胞儀鑒定其純度為90%以上。以1×106cells/ml的濃度鋪于24孔板,分別加入1 μg/ml LPS(LPS組,2只),20 μg/ml PPC(PPC組,2只),1 μg/ml LPS+20 μg/ml PPC(PPC+LPS組,2只),同時設等體積PBS為陰性對照的PBS組(2只)。每組設3個重復孔。置于5% CO2培養箱中培養24 h后,收集上清及細胞沉淀,備用。

1.2.2 DC表型測定 用PBS重懸細胞沉淀,加入流式管,每管200 μl,混勻后,分別加入CD11c-FITC/CD40-PE/CD80-PerCP-Cy5.5/CD86-PE-Cy7/MHC-Ⅱ-APC抗體,同時設置空白對照及單標管。避光室溫反應30 min后,用流式染色緩沖液洗滌1次,每管各加入100 μl流式染色緩沖液重懸細胞,用FACSCanto Ⅱ流式儀進行上機檢測,FlowJo 7.6.1軟件分析數據。

1.2.3 細胞因子檢測 采用小鼠炎癥因子檢測試劑盒檢測細胞培養上清中IL-6、TNF、MCP-1、IL-12p70、IL-10的水平。具體標記方法參照說明書。將標記好的樣本用流式細胞儀進行檢測,利用FCAP 3.0軟件進行細胞因子濃度的換算。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PPC對DC表型分化的影響 PPC組DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS組的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且顯著低于LPS組的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)。PPC+LPS組 CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分別為(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,顯著低于LPS組(P<0.01)。

2.2 PPC對DC分泌炎癥因子的影響 PPC組培養上清中IL-6、TNF的含量分別為(4.27±0.57)、(123.18±8.82)pg/ml,與PBS組的(9.44±4.06)、(139.35±45.87)pg/ml比較差異無統計學意義(P>0.05)；但顯著低于LPS組的(48.23±7.85)、(471.40±61.07)pg/ml(P<0.01)。PPC+LPS組IL-6、TNF水 平分別為(4.32±0.93)、(121.47±13.37)pg/ml,顯著低于LPS組(P<0.01)。PBS組、PPC組和LPS組的MCP-1水平分別為(18.13±1.38)、(22.51±10.47)、(19.86±2.15)pg/ml,三組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。而PPC+LPS組的MCP-1水平為(11.43±1.51)pg/ml,明顯低于LPS組(P<0.01)。

3 討論

本研究利用體外模型探討了PPC對DC的抑制作用,發現PPC可下調DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表達,抑制IL-6、TNF等炎癥因子分泌,并能抑制LPS誘導的DC活化及炎癥反應,提示PPC可通過作用于DC發揮抗炎效應。

PPC是一種臨床療效較為肯定的護肝藥［1］,含有PC和大量不飽和脂肪酸。其化學結構與內源性磷脂一致,可直接影響膜結構,使受損肝功和酶活恢復正常；也可調節肝臟能量平衡,將中性脂肪和膽固醇轉化成容易代謝的形式,從而發揮護肝作用。本研究發現PPC可通過作用于DC誘導抗炎作用,可為進一步開發PPC作為抗炎藥物奠定基礎。

［1］胡國平,劉凱,王甦,等.多烯磷脂酰膽堿(易善復)治療慢性肝炎的系統評價.中國循證醫學雜志,2005,5(7):543-548.

［2］張民杰,楊敏,張宗權.易善復治療黃褐斑療效分析與評價.臨床合理用藥雜志,2011,4(5C):51-52.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.24.125

2016-10-25］

江蘇省教育廳高校自然科學研究基金面上項目(項目編號：15KJB310025)；江蘇省博士后科研資助計劃(項目編號：1501061A)；徐州醫學院優秀人才啟動基金(項目編號：D2015004)

221004 徐州醫科大學病原生物學與免疫學教研室、感染與免疫實驗室(潘偉 郝文婷 李向陽徐慧雯)；形態學實驗教學中心(孫芬芬)

孫芬芬