BMSCs對糖尿病腎病大鼠的治療作用及機制探討

張袁，高克瑜，戴春

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221000；2 徐州醫學院附屬醫院)

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BMSCs對糖尿病腎病大鼠的治療作用及機制探討

張袁1，高克瑜1，戴春2

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221000；2 徐州醫學院附屬醫院)

摘要：目的觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)對糖尿病腎病(DN)大鼠的治療作用，并探討其作用機制。 方法將20只DN造模型成功大鼠隨機分為觀察組和對照組各10只，分別于造模4周尾靜脈輸注BMSCs、生理鹽水；另選10只正常大鼠作為空白組，不做任何處理。造模12周，檢測各組24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、血糖、裂孔隔膜蛋白(nephrin)和肌間線蛋白(desmin)水平。結果與空白組比較，對照組及觀察組血糖、24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表達升高，nephrin表達減少(P均<0.05)；與對照組比較，觀察組24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表達降低，nephrin表達增加(P均<0.05)。結論BMSCs對DN大鼠腎臟具有治療作用，可能與其改善足細胞EMT有關。

關鍵詞：糖尿病腎病； 骨髓間充質干細胞； 上皮間充質轉分化;足細胞；裂孔隔膜蛋白；肌間線蛋白

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者的常見并發癥，是導致終末期腎病(ESRD)的最主要病因。研究發現，足細胞損傷在DN的發生、發展中起關鍵作用[1]。上皮間充質轉分化(EMT)是DN足細胞損傷的早期事件，表現為上皮細胞標志物如裂孔隔膜蛋白(nephrin)水平降低，間充質細胞標志物如肌間線蛋白(desmin)水平升高，導致細胞足突融合，腎小球濾過屏障受損，最終導致尿蛋白水平增高[2]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種具有多項分化潛能的干細胞，在體內能趨化、歸巢至受損組織中，分化或修復組織[3]。研究發現，BMSCs可延緩DN病情進展、降低蛋白尿，但具體機制尚不清楚[4]。2014年6～12月，我們觀察了BMSCs對DN大鼠的治療作用，并探討其作用機制。現報告如下。

1材料與方法

1.1材料大鼠BMSCs由本實驗室培養。8周齡健康SPF級雄性SD大鼠38只，體質量200～250 g，購自徐州醫學院動物實驗中心。鏈脲佐霉素(STZ，Sigma)；胎牛血清(杭州四季青)；改良Eagle培養基(北京賽默)；CD90-FITC(Biolegend)、CD29-FITC、CD45-PE (Ebioscience)；兔抗大鼠nephrin多克隆抗體(武漢博士德)；兔抗大鼠desmin多克隆抗體(無錫藥科美生物科技有限公司)；羊抗兔二步法免疫組化試劑盒(二抗)；IRDyeTM800 標記的山羊抗兔抗體(二抗)。

1.2分組與處理取28只大鼠根據文獻[5,6]采用STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射方法制作糖尿病模型。造模3 d后連續3 d尾靜脈檢測血糖，血糖均>16.7 mmol/L則造模成功。造模后4周若大鼠尿量>原尿量150%、尿蛋白>30 mg/24 h尿則視為DN模型造模成功。最終造模成功20只，隨機分為觀察組和對照組各10只，另選10只健康大鼠為空白組。觀察組于DN造模成功4周時通過尾靜脈輸注BMSCs2×106，對照組同時尾靜脈注射生理鹽水1 mL，空白組不做任何處理。

1.3 24 h尿蛋白量、血糖、血肌酐(Scr)測定干預8周后檢測24 h尿蛋白量、血糖、Scr。

1.4腎組織足細胞nephrin、desmin檢測采用Western blot法。各組大鼠斷頭處死后取部分腎臟組織，電泳、轉膜、牛奶封閉后加入兔抗大鼠nephrin、desmin抗體。4 ℃孵育24 h，加入二抗(1∶1 000 IRDyeTM800 標記的山羊抗兔抗體)，室溫避光孵育2 h, Odyssey激光成像系統掃描，圖像用Image J軟件分析。以β-actin作為內參照，測定蛋白的相對表達量。

2結果

2.1各組24 h尿蛋白量、血糖、Scr比較見表1。

表1　各組24 h尿蛋白量、血糖、Scr比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

2.2各組足細胞nephrin、desmin表達比較見表2。

表2　各組足細胞nephrin、desmin表達比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

3討論

足細胞損傷是DN早期重要病理特征[1]，蛋白尿形成與足細胞損傷密切相關[7,8]。近年研究認為，EMT在DN足細胞損傷中發揮重要作用[9,10]。足細胞是一種高度特異、終末分化的腎小球臟層上皮細胞，是由后腎中胚層的間充質細胞向上皮細胞轉分化發育而來，并通過以肌動蛋白為主的細胞骨架系統和足細胞特異表達的蛋白分子，在腎小球結構和功能上發揮著重要作用。研究發現，炎癥、缺血缺氧、高血糖、全身免疫系統疾病等因素均可導致腎臟細胞內環境的改變，使得轉分化因子與逆轉分化因子之間失去平衡，導致EMT[11，12]，從而導致腎小球濾過屏障受損，尿蛋白水平升高，腎小球硬化[2,9,10]。足細胞表型即足細胞成熟的蛋白標志物，包括足細胞表面蛋白分子和nephrin分子。nephrin是維持裂孔膜完整性的不可缺少的分子。細胞發生EMT時，將失去成熟足細胞的上皮細胞樣表型標志物如nephrin、緊密連接蛋白-1、P鈣黏蛋白等，而表達上調間充質細胞樣表型標志物如desmin、成纖維細胞特殊蛋白-l、整合素連接激酶、細胞外基質纖維連接蛋白、膠原I和基質金屬蛋白酶9等[13]。

BMSCs是一類具有自我更新、多向分化潛能、免疫調節和低免疫原性的細胞，具有向骨、軟骨、肌肉、脂肪等多向分化能力[3，14]。實驗表明，BMSCs可向腎實質細胞轉化，以往廣泛用于各種腎病模型的實驗研究[15]。近來研究發現，在阿霉素[16]和氨基核苷嘌呤霉素誘導的腎病模型中給予BMSCs可明顯降低蛋白尿水平，減輕足細胞損傷。在1型和2型糖尿病動物模型中給予BMSCs同樣可顯著降低蛋白尿水平，減輕足細胞的損傷和丟失[4,14]。本研究發現，對照組足細胞上皮細胞標志蛋白nephrin表達明顯降低，間充質細胞標志蛋白desmin表達明顯升高，提示DN大鼠足細胞存在EMT過程。同時本研究還發現，BMSCs能明顯改善足細胞上述病理變化降低蛋白尿，而對血糖水平無明顯改善作用。提示BMSCs對DN有一定治療作用，且該作用獨立于降糖作用之外，可能與降低足細胞EMT過程有關。

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收稿日期：(2015-07-19)

通信作者：戴春

中圖分類號：R587.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)46-0030-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.011