急性髓細胞白血病 FLT3-ITD融合基因突變及其研究進展

楊 楊，任建新，盧振霞

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 腫瘤血液內科，吉林 長春130033)

*通訊作者

急性髓細胞白血病 FLT3-ITD融合基因突變及其研究進展

楊 楊，任建新，盧振霞*

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 腫瘤血液內科，吉林 長春130033)

急性髓細胞白血病(acute myeloid luekmia，AML)是造血干細胞惡性克隆性疾病。幾乎所有刺激細胞增殖的生長因子信號都是通過酪氨酸激酶受體通路傳導的，其在白血病細胞增殖中起到了重要的作用。

1 FLT3-ITD分子結構特點

Fms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase3,FLT3)是原癌基因，位于染色體13q12，屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族.。近來研究發(fā)現FLT3基因的異常表達、突變與AML的發(fā)生、發(fā)展預后有密切的關系[1]。酪氨酸激酶受體基因FLT3的內部串聯重復序列(FLT3 internal tandem duplications,FLT3-ITD)是一種近膜區(qū)的突變，稱為FLT3-ITD，由Nakao等[2]首先報道。FLT3-ITD突變主要集中在FLT3基因的14至15外顯子而ITD突變導致FLT3受體的持續(xù)自身磷酸化，與其配體結合后經二聚體化和自身磷酸化被完全激活[3]，并激活下游RAS/MAPK、P13K通路，同時有STAT5通路的短暫激活。FLT3-ITD突變持續(xù)激活這些信號通路，并通過內質網中形成的不成熟受體激活STAT5通路。FLT3-ITD突變不依賴生長因子，其形成第一個胞內酪氨酸結構域自主磷酸化，激活Ras和STAT5途徑使造血細胞活化和自我增殖，導致AML發(fā)病及復發(fā)。研究表明FLT3-ITD在疾病過程中是不穩(wěn)定的，與疾病狀態(tài)有關，完全緩解后FLT3-ITD可以是陰性的，復發(fā)后則可以再次轉為陽性[4]。近年由于全基因組測序分析提出新的觀點，FLT3-ITD作為驅動突變與白血病發(fā)生及靶向治療有關，之后發(fā)生的其他協同突變與疾病進展有關[5]。

2 FLT3-ITD及FLT3的臨床特征

在FAB亞型中，FLT3-ITD突變在M3的陽性率最高，M5次之，M2、M6、M7的陽性率較低。外周血白細胞和骨髓中白血病細胞明顯增高的初治AML常伴FLT3-ITD突變[6]。FLT3-ITD突變在AML中是獨立預后不良的因素。FLT3 mRNA幾乎在所有AML患者中均陽性，在FAB分型中，其在M5最高，M3最低，可能與FLT3的主要作用是促增殖而M3以分化障礙為主[7]。在AML中，FLT3及其受體通過自分泌及旁分泌促進異常克隆細胞的增殖和維持。因此，FLT3與AML外周血白細胞計數存在相關性，FLT3表達越高，白細胞計數越高。

目前白血病的完全緩解率有很大提高，但緩解后復發(fā)仍是治療難題。微小殘留病(minimal residual disease,MRD)與白血病的復發(fā)密切相關。MRD指白血病經過治療完全緩解后殘留在體內少量的白血病細胞。檢測MRD是白血病治療的另一個重要措施，可以早期預測復發(fā)，指導臨床個體化治療。以往研究顯示FLT3-ITD突變不穩(wěn)定，不適用于MRD的監(jiān)測[8]。但采用串聯聚合酶鏈反應(tandem duplication polymerase chain reation,TD-PCR)監(jiān)測FLT3-ITD突變的移植后患者復發(fā)較PCR更敏感。應用TD-PCR可能使FLT3-ITD成為監(jiān)測MRD的敏感指標[9]。最新研究表明，第二代測序法(Next-generation sequencing， NGS)克服了基因診斷技術難題。敏感的NGS可以區(qū)分多克隆及復雜的多基因突變，并能定量突變基因[10]。因此NGS可以檢測到AML患者疾病過程中的FLT3突變，即使是存在復雜突變。超深焦磷酸測序(amplicon-based ultra-deep sequencing，UDS )技術可以在初治FLT3-ITD陰性的患者進展或復發(fā)時檢測到FLT3-ITD突變，用UDS方法回顧這些患者FLT3-ITD狀態(tài)，可以檢測少量的ITD陽性克隆，這是普通方法檢測不到的[11]。

3 FLT3-ITD突變的AML患者的靶向治療

AML的發(fā)生需要多次基因突變，而多種異常基因從促進細胞增殖、阻礙分化、抑制凋亡、干擾細胞周期等方面作用于粒系干/祖細胞，導致AML的發(fā)生、發(fā)展。雖初治的AML完全緩解率超過70%，但僅有30%的患者可以長期無病生存。

因分子生物學的發(fā)展，發(fā)現與AML密切相關的基因，為個體化治療提供依據。由于FLT3基因與AML發(fā)生密切相關，針對FLT3的靶向治療是研究熱點。在懸浮培養(yǎng)中，FLT3-TKI主要是加速FLT3突變細胞系和AML原始細胞的凋亡，可能由于骨髓中產生了配體及其他細胞因子，使骨髓中原始細胞的凋亡較少[12]。所以應用FLT3抑制劑誘導FLT3-ITD突變的白血病細胞凋亡，抑制的程度需要更深入和持久[13]。目前多種FLT3抑制劑均為雜環(huán)化合物，具有腺苷嘌呤環(huán)的相似結構，可以插入FLT3的ATP結合位點，阻止其磷酸化。第一代FLT3酪氨酸激酶抑制劑特異性差，即使是第二代FLT3抑制劑，最初也是抑制其他受體的，所以第一二代FLT3抑制劑療效差。Quizartinib(AC220)認為是首個特異性靶向作用于FLT3的抑制劑[14]。AC220比第一二代的FLT3酪氨酸抑制劑有更確切的療效及特異性。更重要的是其顯著的臨床效果可能改變FLT3突變的AML的治療結果。

AC220的結果，Quizartinib可作為FLT3抑制劑治療FLT3-ITD突變的AML[15]。Quizartinib一期臨床應用于難治、復發(fā)的AML患者中。研究終點是Quizartinib的安全性、耐受性和藥動力學[16]。患者最初口服Quizartinib 12mg/天，口服2周后間歇2周，然后持續(xù)口服。76名患者入組，17(22%)名患者有FLT3-ITD突變，37(49%)個無FLT3-ITD突變，22個未檢測FLT3-ITD。持續(xù)用藥的最大耐受劑量為200 mg/天，劑量限制性毒副作用主要是無癥狀的心臟復極間歇延長，表現在QT間期延長；其他3/4級毒副作用主要是貧血、血小板減少、疲勞。23例出現治療反應，其中包括2個完全緩解(CR)，3個完全緩解伴血小板未完全恢復(CRp)，5個完全緩解伴血象未完全恢復(CRi)，13個部分緩解。中位反應時間是13.3周，中位生存期14周。在試驗中，Quizartinib在預后不良的患者中有較高的反應率且耐受性良好。所以持續(xù)200 mg/天的最大耐受劑量作為Ⅱ期臨床的劑量。隨之Quizartinib I期臨床，已開放Quizartinib 5個臨床研究。其中最大的一個臨床研究是單獨應用Quizartinib治療難治、復發(fā)的AML患者。入組62個患者，男性劑量135 mg/天，女性劑量90 mg/天，劑量減量是由于無癥狀、不可逆的QT間期延長發(fā)生率較高。應用改良的方案，2組患者入組[17-18]。第一組入組133名患者，其中92名FLT3-ITD突變陽性，41名無突變，入組患者年紀≥60歲，均是初治難治或是第一次復發(fā)。FLT3-ITD突變陽性的患者，治療的完全緩解率為54%(0CR;3%CRp;51%CRi)，中位治療反應時間12.7周，中位總生存時間25.3周。FLT3-ITD突變陽性的難治患者達到39%的完全緩解率，陰性的患者完全緩解率為32%(2%CR;2%CRp;27%CRi)。第二組入組年紀較小的患者，99名FLT3-ITD突變陽性患者，38名無突變，均為二線治療后難治或復發(fā)。這一組治療反應率與第一組相似，FLT3-ITD突變陽性的完全緩解率44%(4%CR;0%CRp;40%CRi)，無FLT3-ITD突變的反應率34%(3%CR;3%CRp;29%CRi)。第二組反應率與第一組相似，但是年輕的CRi患者可以選擇異基因造血干細胞移植。

基于Quizartinib I Ⅱ期臨床試驗中較高緩解率和較輕的毒副作用，使之有望在短期內應用于臨床，治療FLT3-ITD陽性的AML患者。

近期研究表明，T-LAK蛋白源激酶抑制劑(T-LAK cell-originated protein kinase inhibitor，TOPK inhibitor)(OTS514)或可成為FLT3-ITD陽性的AML患者新的治療方法。TOPK是蘇氨酸蛋白激酶，與腫瘤細胞的有絲分裂及增殖有關[19]，其在睪丸及胎兒組織中表達，在其他正常組織幾乎不表達，卻在一些預后較差的腫瘤表型中高表達；研究表明，TOPK在大部分的AML細胞系中高表達[20]。從3個AML患者中獲取白血病細胞，分別用不同劑量的OTS514治療，發(fā)現白血病細胞的凋亡與OTS514劑量相關。而從AML患者及正常人中分別獲得CD43+細胞，均應用OTS514，結果發(fā)現AML-CD43+增殖明顯下降，而正常人CD43+細胞增殖無變化。可見OTS514僅對AML-CD43+有細胞毒作用。由此可見，TOPK抑制劑OTS514可以促白血病細胞凋亡及降低細胞增值能力，但對正常細胞影響較小[21]。

為了明確白血病中是否存在特殊亞型對TOPK抑制劑(OTS514)敏感，選擇具有不同分子及細胞遺傳突變的10個AML細胞系，分別應用不同劑量的OTS514，結果表明不同亞型的細胞系對OTS514的敏感性不同，有FLT3 突變的細胞系 (MV4-11,MOLM13 and KOCL-48) 較其他細胞系更敏感(Mann-Whitney U test,P=0.016) 。進一步研究 MV4-11 和MOLM13細胞系(有FLT3-ITD 突變并高表達TOPK),U937 (FLT3陰性并表達TOPK),和 KG1 細胞系 (FLT3野生型伴低表達TOPK)，應用OTS514 濃度40nM 48小時，檢測到 MV4-11和MOLM13 細胞系凋亡率分別增加80%及70%， U937 和 KG1 細胞系凋亡率僅增加40% 和10% 可見TOPK抑制劑對FLT3突變的白血病細胞有較強抑制作用。

目前關于FLT3-ITD基因研究已經取得巨大的進步，開拓了AML治療新思路。

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