多囊卵巢綜合征生物樣本庫建設及管理

王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

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多囊卵巢綜合征生物樣本庫建設及管理

王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性最常見的一種生殖內分泌疾病，影響世界 5% ~ 10% 的育齡婦女[1]，其臨床表現呈多態性，包括月經紊亂或稀發、閉經，多毛和肥胖，伴卵巢多囊性增大等。PCOS 與不孕和肥胖有關，可增加患 II 型糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、氧化應激、血脂異常和心血管等疾病的終身風險[2]，PCOS 的研究已經取得了很大的進展，但是發病機制至今不明，目前認為是環境[3]和遺傳因素[4]的共同作用的結果。PCOS 基因組研究揭示異?；蚋淖儏⑴c多方面生物過程，主要包括細胞分化[5]、細胞增生[6]、細胞凋亡[7-8]、基因[9]及蛋白表達[10]等。明確多囊卵巢綜合征發生發展的機制、個性化治療方案、療效的隨訪、藥物敏感性研究及新藥研發等離不開大量的生物樣本，因此，江蘇省蘇北人民醫院建立了高質量、標準化、規范化、信息化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫。

生物樣本庫又稱生物銀行（biobank），主要是指標準化收集、處理、儲存和應用健康和疾病生物體的生物大分子、細胞、組織和器官等樣本，包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經處理過的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質量控制、信息管理與應用的系統。我院生物樣本庫規劃為樣本處理區和樣本存儲區，目前存儲設備可滿足 40 萬 ~ 50 萬份大規?？蒲袠颖敬鎯π枨?，希望能夠為多囊卵巢綜合征早期干預、抑制疾病發展提供強有力的支持。

1 材料與方法

1.1 組織架構

我院生物樣本庫設有管理委員會、學術委員會及倫理委員會，由專職人員負責管理。

1.2 環境設施

生物樣本庫占地面積約 400 m2，設有標本取材室、體液處理室、組織處理室、核酸提取室、資料室及低溫存儲室。主要設備有–196 ℃液氮罐（Taylor-wharton）、–86 ℃超低溫冰箱（Thermo）及室溫石蠟切片柜、24 h 溫控系統（Haier）、4 ℃低溫離心機（Thermo）、制冰機（Panasonic）、低溫條碼打印機（Brady）、石蠟切片機（Leica）、冰凍切片機（Thermo）、全自動封片染片機（Sakura）、超微量分光光度計（Thermo）、凝膠成像系統（Bio-Rad）等。

1.3 信息系統

采用無錫唐頤生物樣本庫智能信息管理系統，可根據臨床資料個性化設置需求模塊。液氮罐、冰箱、石蠟柜均實現可視化存儲，能夠與院內 HIS、LIS、PACS 接口對接，實時獲取臨床資料。貝迪打印機、掃碼機、條碼采用低溫二維碼打印并于標簽顯示其樣本編碼、采集日期、類型、存儲方式以及存儲位置等。例如，PC-1600720-BS-F-02，代表多囊卵巢綜合征，2016 年第 720 號入庫，血清，冰凍存儲，第二復份。

1.4 流程管理

按照中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準[11]、國際生物和環境樣本庫協會（ISBER）樣本庫管理規范[12]，結合我院實際情況制定生物樣本庫制度職責及標準操作流程（SOPs），其中包括人員管理、儀器設備管理、實驗管理、醫院感染管理、檔案管理，樣本采集、處理、存儲、質量控制、運輸流程、銷毀管理等。

多囊卵巢綜合征生物樣本庫的建立已通過江蘇省蘇北人民醫院倫理委員會審核，具體采集計劃由臨床科室、樣本庫工作人員共同制定并確定一名臨床協調人員，每日可采集病例由臨床醫生確定并簽署知情同意書，一式三份，由臨床科室、生物樣本庫、患者各執一份留存。

1.5 臨床資料收集

我院 PCOS 入庫樣本臨床資料已達到標準化、規范化，其中包括：基本信息（姓名、性別、年齡、身份證號、家庭住址、聯系方式等），現病史（初診日期、不孕類型、不孕年限、月經是否規律等），既往史（外傷手術史、預防接種史、輸血及輸血制品史），必備的檢驗/檢查（血常規、尿常規、血型、基礎內分泌、TORCH、甲狀腺功能、血胰島素、染色體及陰道 B 超等），診療計劃（ART 方式、周期類型、治療方式、治療方案、用藥方案、精子來源方式、卵子來源、存儲方式以及培養方式等），手術記錄（取卵日期、取卵時間、麻醉方式、卵巢大小、卵泡數量等），胚胎移植記錄（移植日期、移植時間、子宮位置、導管進入宮腔次數、移植個數、胚胎殘留、有無污染及移植后用藥等），卵子處理記錄（取卵日期、取卵時間、穿刺卵泡數、獲卵數等），胚胎培養情況（培養囊胚數、形成囊胚數、高評分囊胚數、囊胚胚胎移植數等）以及隨訪資料等。

1.6 血液標本采集流程

符合納入標準的患者均采集血液標本，血液樣本進行術前血采集，其中 8 ml EDTA 抗凝和 5 ml 非抗凝真空采血管采集靜脈血。詳細填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫離心 10 min，分離血清、血漿，按照每管 300 μl分裝成 5 份，400 ×低溫離心 30 min，于白膜層部提取白細胞，按照每管 300 μl 分裝成 3 份，所有流程在 2 h 內分裝完畢，置于–80 ℃保存。

1.7 卵泡液標本采集流程

符合納入標準的患者均進行卵泡液標本采集，術中穿刺卵泡液 50 ml，詳細填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫 3000 r/min 離心 10 min，分離上清、沉淀，按照每管 15 ml 分裝成 3 份并于–80 ℃保存。

1.8 質量控制流程

我院多囊卵巢綜合征樣本庫定期對庫內樣本隨機抽檢進行質量控制，分別對 DNA 質量、定量和純度、RNA 完整性以及樣本的位置信息、臨床信息（基本信息、手術記錄、臨床診斷、必須檢查、輔助檢查、治療方案、隨訪信息）等規范性及完整性進行檢測檢查，同時第一時間獲取科研使用者結果反饋。

2 結果

我院生物樣本庫已建有三種存儲方式，分別為–196 ℃大型液氮存儲、–86 ℃低溫冰箱存儲以及室溫存儲，多囊卵巢綜合征卵泡液及血液樣本于–86 ℃低溫冰箱存儲，同時按照標準化操作流程實施多囊卵巢綜合征采集計劃。截至 2016 年 10 月 28 日，我院成功收集百余例多囊卵巢綜合征（包括原發不孕、繼發不孕、子宮內膜異位癥等）卵泡液（上清、沉淀），血液樣本（血清、血漿、白細胞）。樣本核酸提取及鑒定結果顯示，DNA 完整性、RNA 純度及總量完全滿足科研需求。

3 討論

近年來，轉化醫學已經成為基礎醫學研究與臨床治療連接，快速實現科學研究向工程應用的重要學科。生物樣本庫的構建能夠將大量的臨床獲取的有效樣本統一標準化、規范化采集、處理，將疾病標本充分地用于基礎性研究。使得臨床疾病標本能夠更加有效利用，基礎研究的取樣來源更加快捷可靠。樣本庫對于樣本的信息直接從臨床管理系統中獲取，來源更加準確快捷，避免了中間人工傳抄的誤差，同時又能夠快速地將實驗研究的信息反饋于臨床的?？漆t生，信息傳達位點更加精確，打破了傳統醫學研究到應用發展模式中的基礎研究和臨床應用之間的堅冰壁壘，使得基礎信息和臨床思維反復快速地整合，極大地促進了轉化醫學研究的發展。

隨著自然環境因素和社會心理因素的改變，相比過去，年輕的生育群體中不孕不育以及多囊卵巢綜合征患者數量呈明顯升高趨勢。尤其我國開放了二胎政策后，生育能力已經明顯下降的大齡婦女要求生二胎的需求在不斷增多。越來越多的人群開始關注生殖健康問題，多囊卵巢綜合征除了會導致月經稀發和不孕不育等，還與代謝疾?。ㄌ悄虿13]、胰島素抵抗[14-15]、代謝綜合征等[16]），心血管疾病[17]，腫瘤（子宮內膜癌[18]）等問題有較高的關聯性和并發性?；谌和暾纳飿颖編鞂崟r更新和信息的共享，可以完整地評價疾病標本對于開展的各項相關研究的價值性，有選擇地參與多囊卵巢綜合征不同方向、不同層次、不同組別的實驗隊列研究。此外，多囊卵巢綜合征的生物標本，尤其是卵泡液標本，采集技術要求高，來源方式單一，基于多囊卵巢的相關調查研究，在樣本容量和樣本代表性上有很大的困難需要克服。

我院有發展規模成熟的生殖中心，長期穩定地開展各項輔助生殖技術，在院內已有的生物樣本庫的基礎上，增設多囊卵巢綜合征生物樣本庫，可以實時跟蹤利用輔助生殖技術行卵巢穿刺取卵術過程中獲取的卵泡液標本，并進行信息化管理與應用。堅持“來源于臨床，服務于科研，資源共享、開放利用”的原則，極力構建標準化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫，深入開展多囊卵巢綜合征及不孕不育等相關疾病的基礎研究，促進多囊卵巢綜合征相關的轉化醫學的發展。

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國家自然科學基金（81601343）；揚州市自然科學基金（YZ2016110）；揚州市科技計劃項目（YZ2015068）；江蘇省蘇北人民醫院院基金（yzucms201425）

225001 揚州大學臨床醫學院/江蘇省蘇北人民醫院生物樣本庫（王麗萍、魯軍、潘云龍），生殖醫學中心（張曉梅、呂芳、潘宇、李雪麗、何笑）

潘云龍，Email：yzpyl@medmail.com.cn

2016-11-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.013