雄性生殖氧化應激損傷的研究進展

樊　華, 李　文

第二軍醫大學長征醫院生殖醫學中心, 上海　200003

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·綜述·

雄性生殖氧化應激損傷的研究進展

樊華, 李文*

第二軍醫大學長征醫院生殖醫學中心, 上海200003

[關鍵詞]抗氧化劑;活性氧簇；超氧陰離子;睪丸

Research progress of oxidative stress injury in male reproduction

FAN Hua, LI Wen*

Center of Reproductive Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

[Key Words]antioxidant; reactive oxygen species; superoxide anion; testis

近年來，每年都有許多研究專注于不同病理條件下的抗氧化劑的影響。這些研究結果顯示大多數疾病中都有自由基(活性氧和氮自由基)的參與。有明確的證據顯示，活性氧(氧化應激)和活性氮(硝化應激)數量的增加是許多急、慢性疾病(包括衰老過程)的突出特點。氧化/硝化應激與以下疾病的發病機制有關：心血管功能障礙，如高血壓、腦血管意外、心力衰竭；生殖功能障礙；感染性休克；衰老和許多與年齡有關的慢性疾病，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、類風濕性關節炎和神經退行性疾病。

1男性生殖系統

男性生殖系統由睪丸和附屬器官組成。睪丸是主要的男性生殖器官，它主要負責精子生成和雄激素的產生。精子生成是雄性生殖細胞向精子轉變的過程，主要發生在曲細精管中。精子發生是一個連續的過程，包括生殖細胞的有絲分裂。該過程導致細胞形態發生廣泛變化，并最終進行減數分裂，產生單倍體精子[1]。這個過程需要睪丸內較高水平的睪酮激素，該激素由睪丸間質細胞產生[2]。已經證明睪酮的分泌直接依賴于促黃體生成激素(LH)的循環水平，LH是由垂體前葉分泌的[2-4]。腦垂體也分泌卵泡刺激素FSH[3-4]，FSH與附著于生精小管支持細胞上的特異性FSH受體結合，引起這些細胞的生長并分泌多種生精物質，如精子細胞正常發育所需的營養、礦物質和生長因子。此外，垂體前葉還分泌催乳激素，支持細胞分泌抑制素，這兩種激素已被證明在精子細胞的正常發育中發揮調控作用[3-5]。此外，一個涉及下丘腦的反饋機制調控著這些激素的釋放。眾所周知，睪丸功能的啟動依賴于下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)，該激素刺激FSH和LH作用于睪丸[3-4]。睪丸反過來又通過在Sertoli細胞(如抑制素)和Leydig細胞中產生激素，對促性腺素(FSH和LH)的生成負反饋控制。因此，通過下丘腦、垂體和睪丸(下丘腦-垂體-睪丸軸)之間的相互關系，睪丸的功能受到局部細胞和內分泌細胞的嚴格控制。

正常的生殖功能對人類生殖和性滿足至關重要。因此，生殖功能障礙(不育)是一個重大的健康挑戰，正確理解其病理生理對此類疾病的有效治療也至關重要。雖然生育能力會隨著年齡的增加而下降，但不育通常是生殖功能障礙引起的，在男性中比女性中更為常見[6]，其中至少有20% 的患者患有內分泌紊亂，包括睪酮和FSH[6]。從目前的幾項研究報告中可以看出男性生殖功能障礙與氧化/硝化應激有關聯[7]。正常精子發生和精子功能受損是男性因素性不孕最常見的原因[6-7]。正常精子的數量和質量，包括運動、獲能、頂體反應、穿透卵子和精子頭部解聚，是實現受精必不可少的過程。然而，大量的研究表明，這些過程的障礙與氧化應激相關的機制有關[8]。

2睪丸中的ROS生成和抗氧化系統

有充分的證據表明，需要低水平的內源性ROS對必要的精子功能進行調控，如獲能、頂體反應、精卵融合[9]等。然而，生精細胞是高度敏感的，容易受到高濃度ROS的影響[7]。因此，通過自由基清除/抗氧化系統的參與來維持睪丸環境中的氧化還原平衡對正常的睪丸功能是至關重要的。

正如在男性不育患者的精子中觀察到的[10]，通過在精子質膜水平的NADPH氧化酶系統參與的反應、或通過線粒體中的NADH依賴的氧化還原酶(心肌酶)，均可以產生ROS。不同的研究者已經確定了高ROS產生的來源，包括未成熟的和異常的精子[9]，這些精子中有白細胞[11]污染，血清和精漿中有低的清除/抗氧化活性[12]。作為對包括炎癥和感染等不同刺激的應答，通過幾種機制精液中白細胞被激活，可以產生比正常精液相對更高(高達100倍)的ROS[13]。通過己糖磷酸支路，激活的白細胞使NADPH的生成增加，而兩種被激活的多形核(PMN)白細胞和巨噬細胞的代謝過程引起呼吸爆發和高水平的ROS生成。在精子分析過程中，精液也可能通過精子處理方法在體外產生ROS，如過度離心、冷凍/解凍等，以及當精子處理液中有低清除/抗氧化活性存在時[8，12]。

為了保持睪丸內的氧化還原平衡，保護精子免受氧化損傷，精漿中含有大量有效的酶促和非酶促抗氧化系統。已確定的精漿中的酶促抗氧化劑包括SOD[14]、谷胱甘肽過氧化物酶/谷胱甘肽還原酶(GPx/GSR)系統[15]和過氧化氫酶[15]。在類似的研究中，在精漿中已確定的非酶抗氧化劑包括抗壞血酸[16]、維生素E、尿酸[17-18]、丙酮酸[19]、谷胱甘肽、牛磺酸和亞牛磺酸。據報道，一些抗氧化劑還可以提高精子活力/運動性[19]以及正常的精子形態[18]。此外，與不育男性相比，可育男性精漿中抗氧化劑的濃度顯著更高[16-17]。

3睪丸功能障礙的發病機制

通過與膜脂、蛋白質和線粒體DNA相互作用，高水平的ROS(超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、一氧化氮和過氧亞硝基陰離子)對正常精子的生成和質量(活動性、活力和功能)產生不利影響[20]。

3．1精子膜脂質的過氧化哺乳動物精子的膜含有豐富的不飽和脂肪酸(PUFA)，它負責精子的流動性，但同時也使精子對自由基誘導的脂質過氧化損傷非常敏感[20]。細胞膜上的不飽和脂肪酸的取向產生了精子執行其正常生理功能所必需的流動性(例如，在受精過程中的頂體反應和精卵融合)，其中涉及到各種分泌事件。類似的研究還表明，膜結合的ATP酶(離子泵)維持正常細胞內營養和離子(如鈉或鈣)濃度的功能嚴重依賴于細胞膜的流動性。這意味著ROS誘導的膜結構/功能的擾動引起膜流動性損失，從而損害膜泵功能，導致細胞的離子穩態和細胞鈣的利用受到干擾。據報道，細胞Ca2+平衡受損影響精子的活力[21]，并可能導致細胞死亡。缺陷精子面對氧化應激反應尤其脆弱，因為他們包含了過多的不飽和脂肪酸，誘發精子線粒體發生高水平的脂質過氧化作用，產生ROS。更糟糕的是，脂質過氧化作用的小分子質量產物的親電醛，如4HNE或丙烯醛等，也能進一步引起精子線粒體ROS生成[22]。

3.2精子蛋白的過氧化除了影響膜組分和流動性，ROS誘導的蛋白質關鍵硫基的過氧化也可以改變精子的結構和功能，使其對巨噬細胞攻擊的易感性增加[23]。Turner等[8]在關于氧化應激誘導的睪丸功能障礙的綜述中報道稱，H2O2可以擴散通過精子膜，進入細胞并抑制酶的活性，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)。G-6-PD通過己糖磷酸支路控制葡萄糖流量速率，從而控制細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的可用性。精子使用NADPH作為電子來源，為從已知的NDPH氧化酶系統生成ROS提供燃料。氧化性谷胱甘肽(GSSG)經谷胱甘肽還原酶轉換為還原型谷胱甘肽(GSH)時也需要NADPH。G-6-PD的抑制導致NADPH可用性的降低以及隨之而來的GSSG的積累和GSH水平的降低，從而降低精子的抗氧化防御能力，增加膜磷脂的過氧化作用。

3.3精子DNA的過氧化已證明睪丸組織中的氧化應激可以引起精子DNA完整性的過氧化損傷，這已成為男性不育的熱點研究領域。類似的研究已經確定了不育男性精子中的DNA損傷，其特征是高發生率的堿基修飾、DNA片段化、染色質交聯和DNA鏈斷裂[24]。在這些研究中觀察到的DNA損傷是由精子中高水平的ROS引起的。Duran等[25]和Meseguer等[26]已經表明，精子細胞的DNA損傷可以引起精子質量下降和受精問題，因為在受精過程中精子需要完整的DNA。已知精子和其他富含線粒體的有氧細胞也可以發生線粒體DNA(mtDNA)的氧化損傷，在精原細胞階段發生的自由基驅動的事件可以引起精子中多個mtDNA缺失，這與一些男性生殖障礙有關。精子DNA的破壞程度與細胞本身修復能力相關。在精核亞結構和線粒體中包含1種8-氧化鳥嘌呤糖基化酶，稱為8-oxoguanine glycosylase 1 (OGG1)。當精子DNA受到氧化攻擊時，OGG1立即在DNA中剪切8OhdG，并將其氧化形式排出細胞外，同時產生一個堿基空位。這時需要APE1酶在堿基切除修復通路中發揮作用，而精子不具備這種酶。這個過程需要進入卵母細胞后完成，一旦出錯，將會對子代造成深遠影響。盡管各種原因導致的精子DNA損害不可避免，但在體外嚴重的DNA損害可能不會發生在體內。

ROS誘導的DNA損傷增加了生殖細胞的凋亡率[24],凋亡也被描述為細胞程序性死亡。凋亡產生于引起細胞死亡但不發生炎癥反應的細胞內程序的激活，這種誘導與細胞因子誘導的應激激酶對睪丸血管內皮細胞的E-選擇素的刺激有關聯，這導致睪丸中性粒細胞的募集和睪丸內ROS的增加，從而導致細胞膜的過氧化損傷和生殖細胞凋亡的啟動[27]。雖然，在正常的精子發生過程中，生殖細胞凋亡對消除多余的未成熟精子是非常重要的，但如在氧化應激條件(例如，毒素暴露、隱睪、睪丸扭轉等)下可以看到，當進程被上調時，睪丸功能受到高度破壞[28]。Cudicini等[29]和Lysiak等[30]報道稱，生殖細胞凋亡特別影響生精上皮，在重度誘導過程中，Sertoli細胞吞噬大量瀕死的生殖細胞，可能會超過正常Sertoli細胞的過程，啟動了NF- κB參與的促炎癥細胞因子表達的開關，如IL-1和IL-6。

4睪丸血管功能

睪丸內正常的微血管血流量對睪丸的功能是非常重要的，因為據報道，缺乏充足血流量可導致缺血和細胞壞死[30]。在大多數實驗動物中，血管舒縮功能引起微血管血流量的變化[31]。血管舒縮被定義為血管張力有節奏的振蕩，它是由血管和許多組織的局部變化引起的。雖然血管舒縮的生理學意義尚不確定，但有一些證據表明，當灌注受損時，即，在缺血的條件下，它可能作為一種保護機制。Lysiak等[32]報道稱，在他們的研究中，在ROS介導的缺血性再灌注(IR)中發生的睪丸損傷可以引起大鼠睪丸血管舒縮的改變。另外，Collin等[31]表明，在大鼠中，ROS誘導的睪酮下降可以抑制睪丸血管舒縮。此外，Lysiak等[32]也表明，通過睪丸中iNOS和 eNOS的上調，IR事件會增加血管舒張復合物(NO)的表達。已經證實，一旦NO產生，它也會影響血管舒縮。NO參加其他可以促進睪丸損傷的事件，如在大鼠血管內皮細胞的管腔表面的細胞黏附分子(CAMS)的表達以及過氧亞硝酸鹽的生成[33-35]。因為CAMs是白細胞募集的關鍵調節因子，它們在睪丸和其他組織中的IR誘導的損傷中起著關鍵作用。已普遍認為，在器官中，特別是在睪丸中，白細胞募集是許多后續IR病理學變化的先導。

5睪丸內分泌功能

睪丸氧化應激導致睪丸內睪酮量的減少，這可能是Leydig細胞損傷的結果，也可能是內分泌結構，如垂體前葉的損傷引起的[33]。類固醇生成的正常過程中產生ROS，這主要是線粒體呼吸和類固醇細胞色素P450酶的催化反應生成的。已經確認，如果不通過細胞內抗氧化劑加以控制，以這種方式產生的ROS可以引起精子細胞的線粒體膜的氧化損傷，并有助于抑制后續的類固醇生成[34]。在另一項研究中，已經證明睪丸中NO量的增加(隨之形成過氧亞硝酸鹽)可以降低睪酮的分泌[35]。

6誘導睪丸氧化應激的條件

已經確認有幾種條件可以促進睪丸內的氧化應激并導致不育，包括老化、病理狀態和暴露于一些有毒物質。

6.1老化氧化應激被認為參與有氧生物的老化過程[10]。隨著年限年齡的增長，生殖細胞經歷了反復多次的減數分裂復制，突變發生的風險是復制錯誤逐漸疊加的結果。通過激活對氧化還原敏感的轉綠因子，年齡相關的氧化應激可以引起促炎癥基因表達的上調，并建立了ROS與男性不育和年齡相關的病理的關聯[2，10，14，35]。Luo等[34]和Cao等[36]在他們的研究表明，老化與睪丸抗氧化能力降低有關，而Zirkin等[33]報道稱老化與睪酮或類固醇生成的下降有關。

6.2病理狀態各種研究表明，某些病理條件下睪丸的病理生理過程與睪丸中的氧化應激增加有關。睪丸炎、睪丸扭轉、精索靜脈曲張和隱睪是已經被確認的幾種可以引起睪丸內ROS水平上升的疾病[37,39]。睪丸炎的特征是局部睪丸感染或全身性炎癥，而睪丸扭轉是精索扭轉的結果，可導致缺血。精索靜脈曲張是由睪丸上部及周圍的蔓狀靜脈叢擴張(尤其是左側睪丸)引起的，其特點是由于循環障礙而導致的陰囊溫度升高。隱睪是睪丸未降，發生時伴睪丸溫度陰性升高。睪丸的基因組研究表明，局部睪丸感染或炎癥過程引起人類生精障礙[37]。在其他研究中，在試驗睪丸扭轉和精索靜脈曲張的大鼠對側睪丸中觀察到睪丸的氧化應激和損傷。Ishikawa等[38]和Misro等[39]也表明在試驗性隱睪中發生了自由基的過表達和精子細胞的損傷。

6.3暴露于外源性化學物質有資料證明，當暴露于殺蟲劑、工業化學品包括環境內分泌干擾物[39]和金屬，如高劑量的鐵、鎘[6]和鉛[40]時，睪丸發生氧化應激。此外，已報道一些治療藥物，如抗腫瘤藥物、抗菌藥物、抗瘧藥、鈣通道阻滯劑和抗抑郁藥可以通過增加睪丸中的OS損害睪丸功能。也觀察到照射、過量飲酒和煙草煙霧[41]干擾氧化還原平衡。

7結論

過量的ROS會影響氧化還原平衡并導致氧化應激。氧化應激可以通過不同方式對細胞功能產生不利影響，并明顯與睪丸功能障礙和其他疾病的發展相關。抗氧化劑可以使細胞保持足夠的功能，抵抗穩態紊亂，其中包括氧化應激參與的過程。此外，補充抗氧化劑理論上可以保護或防止睪丸結構的過氧化損傷，可能對男性不育有幫助。在過去對通過某些抗氧化劑提高氧化應激引起的不育患者的生育能力這一概念有爭議，但現在，在睪丸功能障礙并進行人工生殖治療的情況下，這一概念得到了相當的關注。因此，對強效抗氧化劑和重要的促炎癥介質的開發和專利申請以及對適當的藥物輸送系統的開發可能使醫學普遍深度受益。

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[本文編輯]葉婷，賈澤軍

[中圖分類號]R 737.21

[文獻標志碼]A

[作者簡介]樊華，主治醫師. E-mail: fanhua20056@163.com*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-81885872, E-mail: lyyliwen@sina.com

[基金項目]軍隊創新重點課題(13cxz006). Supportedyoy Key Project of PLA (13cxz006).

[收稿日期]2016-01-08[接受日期]2016-04-10