一株雞源新城疫病毒的分離鑒定

一株雞源新城疫病毒的分離鑒定

周靈1，李燕芳2，馬夏利3

( 1.海鹽縣畜牧獸醫(yī)局，浙江海鹽314300; 2.海鹽縣畜牧獸醫(yī)聯(lián)站;3.海鹽縣武原鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站)

摘要:從海鹽縣某雞場發(fā)病雞群采集的拭子樣品中分離到1株病毒，血凝試驗、血凝抑制試驗結果表明，該病毒可與1%雞血紅細胞發(fā)生凝集，且這種凝集作用可被新城疫標準陽性血清所抑制。同時進行RTPCR檢測，結果可擴增出目的條帶，進而確定該毒株為雞源新城疫病毒。根據(jù)OIE對新城疫病毒毒力的判定標準和方法對該病毒進行雞胚平均致死時間( MDT)、1日齡易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)和雞胚半數(shù)致死量( ELD50)測定。結果表明，MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL，最終判定該毒株為新城疫強毒株。

關鍵詞:新城疫病毒;分離鑒定;毒力測定

中圖分類號:S858.31文獻標識碼: A

收稿日期:2014-08-15

新城疫是由新城疫病毒( NDV)引起的一種急性、敗血性傳染病，對養(yǎng)雞業(yè)危害極大。目前針對NDV的診斷技術，主要有臨床診斷與實驗室診斷。臨床診斷依據(jù)出現(xiàn)典型的臨床癥狀與病理變化作為判斷標準，但有部分病毒性疾病與ND癥狀相似，所以要借助實驗室才能進一步鑒定。實驗室診斷包括采用雞胚分離法、血凝和血凝抑制試驗( HA和HI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗( ELISA)等技術，同時可用核酸探針技術、RT-PCR、RNA指紋圖譜法等分子生物學技術進行進一步鑒定。區(qū)別NDV毒力的方法很多，包括測定其生物學特性與根據(jù)其分子生物學特性建立的診斷方法等。

通過海鹽地區(qū)雞源新城疫病毒病的流行病學調(diào)查、進行病原學分子流行病學、快速檢測診斷技術的研究，為有效防治雞源新城疫病毒病提供了理論依據(jù)和技術支撐。

本研究以海鹽地區(qū)病雞組織中分離到的病毒為研究對象，進行了病毒分離鑒定，為后期疫苗研制和疫病防控提供了基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料雞口腔拭子樣品采自海鹽縣某雞場發(fā)病雞群，由海鹽縣畜牧獸醫(yī)局實驗室提供; 9～10日齡SPF雞胚購自北京某實驗動物技術有限公司。

主要試劑:宿主菌大腸桿菌( E.coli) DH5a由本室保存，質(zhì)粒pMD18-T Vector、Trizol RNA提取試劑、各種限制性內(nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker膠回收試劑盒、新城疫標準陽性血清、雞禽流感H5、H7、H9，EDS-76標準陽性血清，1%雞紅細胞懸液(由本實驗室配制)等。

1.2病毒分離將接種材料經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚5枚，0.1 mL/枚，37℃孵化，逐日觀察。棄去24 h內(nèi)死胚，每4 h照蛋一次，及時取出死亡雞胚，置4℃保存，無菌收集24～96 h死胚尿囊液; 96 h活胚置4℃過夜后，無菌收集尿囊液。

用SPF雞胚繼續(xù)傳代至第5代，收集尿囊液，－20℃保存?zhèn)溆谩⒉《痉蛛x株命名為HY0920株。

1.3血凝試驗( HA)根據(jù)OIE標準選取96孔血凝板進行血凝試驗，每孔加入生理鹽水25 μL。每排第1孔加入25 μL待檢雞胚尿囊液，充分混勻后，吸取25 μL加入第2孔，充分混勻后，吸取25 μL加入第3孔，依此稀釋，至第11孔。

從第11孔吸取25 μL棄去，第12孔不加待檢尿囊液作為陰性對照。每孔加入濃度為1%的雞紅細胞懸液25 μL，充分混勻。將充分混勻后的血凝板置于37℃溫箱中，感作30 min，觀察鑒定結果。

1.4血凝抑制試驗( HI) 96孔血凝板，每孔加入生理鹽水25 μL，分別于每排第1孔加入ND、EDS-76.AI( H5、H7、H9)標準陽性血清25 μL，充分混勻后，吸取25 μL加入第2孔，再充分混勻后吸取25 μL加入第3孔，依此稀釋，至第11孔。

從第11孔吸取25 μL棄去，第12孔不加待檢血清作為對照。每孔加入含4個血凝單位的病毒液25 μL( 2. 2. 1血凝試驗中出現(xiàn)完全凝集的雞胚尿囊液最大稀釋度為1個血凝單位)。將其充分混勻后置于37℃溫箱感作30 min后，再在每孔中加入濃度為1%的雞紅細胞懸液25 μL，充分混勻。將充分混勻的血凝板置于37℃溫箱，感作30 min，觀察結果。

1.5毒力測定

1.5.1雞胚平均致死時間( MDT)測定將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水進行1∶10稀釋，每個稀釋倍數(shù)分別接種5枚非免疫雞胚，每胚接種尿囊液0.1 mL，37℃溫箱孵育。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每12 h照檢一次，連續(xù)觀察7 d，記錄雞胚死亡時間。

1.5.2易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水1∶10稀釋，腦內(nèi)接種1日齡易感雛雞，每羽接種尿囊液0.05 mL;另設對照組5羽，每羽腦內(nèi)接種滅菌生理鹽水0.05 mL;按分組進行嚴格隔離詞養(yǎng)，觀察8 d，每日進行記錄打分;死亡計2分，發(fā)病計1分，正常計0分。OIE提供的毒力鑒定分型標準: ICPI值0.2～0.5為溫和型，0.5～1.5為中等毒力型，1. 5～2.0為強毒力型。

1.5.3雞胚半數(shù)致死量測定( ELD50)將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水10倍遞次稀釋，分別接種于9日齡非免疫雞胚尿囊腔，每胚接種0.2 mL，每8枚雞胚為一個稀釋組，接種后以石蠟封口，置于37℃溫箱孵育;每天照蛋，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，24 h后死亡雞胚置4℃冰箱保存;連續(xù)觀察5 d，按照Reed-Muench方法計算ELD50。

2　結果與分析

2.1病毒分離培養(yǎng)與試驗結果發(fā)現(xiàn)，雞胚在接種尿囊液后32～72 h全部死亡。

檢查胚體，出血嚴重，呈透明狀，經(jīng)第三次傳代后死亡雞胚時間基本穩(wěn)定在42～60 h，死亡雞胚尿囊液清亮，胚體出血，尤以頭部最為嚴重。

2.2病毒鑒定

2.2.1血凝試驗經(jīng)三次傳代的雞胚尿囊液按照OIE標準進行血凝試驗。結果發(fā)現(xiàn)雞胚尿囊液可凝集濃度為1%的雞胚紅細胞，血凝價為29。

2.2.2血凝抑制試驗經(jīng)三次傳代的雞胚尿囊液按照OIE標準進行血凝抑制試驗，結果發(fā)現(xiàn)采用新城疫標準陽性血清者可以抑制血凝作用，而采用EDS-76、AI( H5、H7、H9)標準陽性血清者則無抑制凝集作用。

2.3毒力測定

2.3.1雞胚最小致死量平均死亡時間( MDT)測定

詳見表1。

表1　HY0920分離株MDT測定結果

由表1可見，可致雞胚全部死亡的最高稀釋倍數(shù)為10－6，MDT =2* 48 +3* 60/5 =55.2 h。

2.3.2易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定詳見表2。

表2　HY0920分離株1日齡雛雞腦內(nèi)接種分離毒后發(fā)病、死亡情況

由表2可見，經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液對雞胚有很強的致死作用，死亡率很高;對照組注射生理鹽水全部正常存活。ICPI =141/80 =1.76。

2.3.3雞胚半數(shù)致死量測定( ELD50)詳見表3。

表3　HY0920分離株ELD50測定

由表3可見，測定的ELD50在8～9之間，按照Reed-Muench計算ELD50，ELD50=10－8.3/0.2 mL，即將病毒懸液作10－8.3稀釋后，接種非免疫雞胚，可使50%非免疫雞胚死亡;每0.2 mL病毒含量為10－8.3ELD50。

3　小結與討論

研究表明，本次海鹽地區(qū)分離到的一株病毒( HY0920)為雞源新城疫強毒株，血凝效價為29。MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL。

目前區(qū)別NDV強弱毒的方法:一是根據(jù)NDV的生物學特性鑒定法評定，包括雞胚平均死亡時間( MDT)測定，腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定，靜脈接種致病指數(shù)( IVPI)測定等;二是依據(jù)NDV強弱毒株F基因的裂解位點差異而建立的各種RT-PCR鑒定法，按照OIE標準測定NDV毒力標準所得結果準確可靠，但工作費時、且有散毒危險。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，國內(nèi)外學者對NDV各個基因序列的研究表明，NDV F蛋白氨基酸基序與毒力密切相關，強弱毒株在裂解位點的氨基酸序列有一定差異。本研究參照Genbank中的NDV強、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列，應用DNA Star軟件Meg Align程序分析及在線軟件Primer Explorer V3，根據(jù)強弱毒株的堿基差異與保守性設計了3套能區(qū)別NDV強弱毒株的LAMP引物，用以區(qū)分NDV強弱毒株。

農(nóng)業(yè)部領導要求堅定不移地推動病死畜禽無害化處理機制建設

農(nóng)業(yè)部新聞辦公室消息:最近，農(nóng)業(yè)部在浙江省嘉興市召開病死畜禽無害化處理機制建設現(xiàn)場會議，總結病死豬無害化處理長效機制試點工作，分析當前形勢，研究部署病死畜禽無害化處理機制建設有關工作。農(nóng)業(yè)部領導強調(diào)，有效解決病死畜禽無害化處理問題刻不容緩。

各地要進一步總結推廣試點工作經(jīng)驗和做法，加強病死畜禽無害化處理體系建設和監(jiān)管工作，堅決杜絕隨意拋棄、經(jīng)營、屠宰加工病死畜禽等違法行為，確保病死畜禽基本實現(xiàn)無害化處理。

一是進一步完善試點工作，把試點區(qū)域建設成示范區(qū)域。

二是大力推廣試點經(jīng)驗，全面推動病死畜禽無害化處理工作的順利開展。

三是嚴格落實國辦意見精神，確保各項政策落實到位。

四是因地制宜，合理規(guī)劃建設無害化收集處理體系。

五是履職盡責，全面強化病死畜禽無害化處理監(jiān)管。

春季是病死畜禽多發(fā)期，做好病死畜禽無害化處理工作尤為關鍵，各地要迅速部署，抓好落實，努力確保不發(fā)生亂拋病死畜禽危害環(huán)境和食品安全的現(xiàn)象。

專題論述