蛋白質指紋圖譜技術在診斷白血病四種分型中的應用

黃　華，　陳林興，　林美冊，　黃靖宇

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院，廣東 汕頭 515041)

蛋白質指紋圖譜技術在診斷白血病四種分型中的應用

黃華，陳林興，林美冊，黃靖宇

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院，廣東 汕頭 515041)

摘要：目的對白血病典型的4種分型血清樣本進行檢測分析，建立白血病分型的蛋白質指紋圖譜診斷模型。方法應用蛋白質指紋圖譜技術檢測16例急性粒細胞白血病M2a、18例慢性粒細胞白血病、14例急性淋巴細胞白血病及16例急性粒細胞白血病M3，采用Biomarker Wizard 及Biomarker Patterns 5.0軟件進行標記物的比較判別，建立決策樹診斷模型。結果由m/z 3 376、8 055及9 421建立決策樹診斷模型，其中16例急性粒細胞白血病M2a檢出率為75.0%(12/16)、9例慢性粒細胞白血病檢出率為100.0%(18/18)、14例急性淋巴細胞白血病檢出率71.4%(10/14)、16例急性粒細胞白血病M3檢出率為87.5%(12/14)。結論由3個蛋白標記峰構成的蛋白質指紋圖譜診斷模型為白血病4種分型的診斷提供了新的借鑒和參考。

關鍵詞：白血病；分型；蛋白質指紋圖譜技術

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0173-04R446.11

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.017

Abstract:ObjectiveTo establish protein fingerprinting model for the diagnosis of leukemia through determining 4 typical types of leukemia. MethodsA total of 16 acute myeloblastic leukemia M2a samples, 18 chronic myelocytic leukemia samples, 14 acute lymphoblastic leukemia samples and 16 acute myeloblastic leukemia M3 samples were determined by protein fingerprinting technology. The comparison of biomarkers was performed by Biomarker Wizard and Biomarker Patterns 5.0 to establish a diagnosis tree model. ResultsThe diagnosis tree model combined with 3 biomarkers ( m/z: 3 376, 8 055 and 9 421) could detect 75% acute myeloblastic leukemia M2a (12/16),100.0% chronic myelocytic leukemia (18/18), 71.4% acute lymphoblastic leukemia (10/14) and 87.5% acute myeloblastic leukemia M3 (12/14). ConclusionsThe protein fingerprinting model established by 3 protein features maybe a novel method for diagnosing 4 types of leukemia.

基金項目：廣東省科技計劃項目(2010B031600272)

作者簡介：黃華，女，1975年生，本科，副主任技師，主要從事骨髓細胞形態學工作。

收稿日期：(2014-08-14)

Application of protein fingerprinting technology in diagnosing 4 types of leukemiaHUANGHua,CHENLinxing,LINMeice,HUANGJingyu.(TheSecondHospitalAffiliatedtoShantouUniversitySchoolofMedicine,GuangdongShantou515041，China)

Key words: Leukemia; Typing; Protein fingerprinting technology

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，具有分化程度的差異性和細胞形態的多形性等特點，其診斷需進行明確分型[1]。國內、外在白血病分型診斷從細胞水平進展到分子水平，但僅靠形態學、免疫組化、遺傳學、分子生物學等，并未達到理想的檢出率[2-3]。

本研究利用蛋白質指紋圖譜技術對白血病典型4種分型血清樣本進行檢測分析，建立白血病分型的蛋白質指紋圖譜診斷模型，為白血病的分型診斷提供幫助。

材料和方法

一、材料

收集白血病4種分型血清樣本，其中16例急性粒細胞白血病M2a、18例慢性粒細胞白血病、14例急性淋巴細胞白血病及16例急性粒細胞白血病M3、白血病患者入選標準：樣本均來自汕頭大學醫學院第二附屬醫院初診患者，男30例，女34例，年齡4～83歲。所有患者均未接受任何治療方案，診斷經臨床、骨髓形態學、免疫組化染色、流式細胞學、染色體檢查，按世界衛生組織(WHO)白血病診斷標準確診。

蛋白質指紋圖譜試劑盒及蛋白指紋圖譜儀I型為湖州賽爾迪生物醫藥科技有限公司產品，All-in-one標準蛋白質芯片為美國Ciphergen公司。

二、方法

1. 樣本收集患者外周血采集后立即放入4 ℃冰箱靜置1～2 h內，4 ℃離心232×g離心5 min分離血清后，4 ℃離心1 000×g離心5 min，去除所有殘留細胞碎片。在冰上將血清轉移到新的離心管中，放入-80 ℃冰箱分裝保存，限凍融一次[4]。

2. 樣本處理(1) 樣本蛋白裂解：離心管中依次加入20 μL U9裂解液(9 mol/L Urea，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCl，1% DTT，pH9.0)，和冰浴溶解的10 μL血清樣本,混勻，靜置30 min；(2) 磁珠活化：WCX納米磁珠與100 μL 清洗液(50mmol/L NaAC，pH 4.0)反應5 min，重復2次；(3) 磁珠捕獲樣本目的蛋白：取360 μL清洗液稀釋已裂解的血清樣本，取100 μL稀釋液加至活化后的磁珠，室溫反應30 min；(4) 目的蛋白洗脫及上樣：取100 μL 清洗液清洗反應后的磁珠5min，重復2次后棄除液體，加入10 μL洗脫液(1%的TFA)混勻， 靜置10 min，取4 μL上清液與4 μL能量吸附分子(Sinapinic acid)飽和溶液充分混勻，吸取2 μL混合液點樣到鋼芯片上，待干后采用蛋白指紋圖譜儀Ⅰ型和賽爾迪蛋白芯片軟件讀取芯片信息。

三、數據采集和標準化處理

采用加有All-in-one標準蛋白質芯片(含有bovine insulin β chain 3 495.9 m/z，human insulin recombinant 5 807.6 m/z，hirudin 7 033.6 m/z 3種蛋白)校正蛋白指紋圖譜儀，使相對分子質量的誤差范圍至0.1%內。蛋白質指紋圖譜儀參數設置為激光強度220，檢測靈敏度7，優化范圍為m/z為2 000 m/z～35 000 m/z，最高50 000。用6 634 m/z對圖譜進行相對分子質量校準，激光粒子流強度標準化系數為1。

四、統計學方法

采用Biomarker Wizard 軟件及Biomarker Patterns 5.0軟件進行標記物的比較判別，建立白血病分型決策樹診斷模型。

結果

一、白血病4種分型蛋白質指紋圖譜診斷模型的建立

16例急性粒細胞白血病M2a、18例慢性粒細胞白血病、14例急性淋巴細胞白血病及16例急性粒細胞白血病M3，用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0軟件進行標記物的比較判別，建立由m/z為3 376、8 055及9 421的決策樹模型(圖1)。模型診斷規則為當M 3 376~28 7.319 2且 M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 ≤11.286 4判讀為急性粒細胞白血病M2a組；當M3 376~28 > 7.319 2判讀為慢性粒細胞白血病組；當M 3 376~28≤7.319 2且M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 > 11.286 4 判讀為急性淋巴細胞白血病組，當M 3 376~28≤7.319 2 且M 9 421~83 > 9.441 81判讀為急性粒細胞白血病M3組。該模型判讀16例急性粒細胞白血病M2a，12例正確，4例錯誤；18例慢性粒細胞白血病均正確；14例急性淋巴細胞白血病，10例正確，4例錯誤；16例急性粒細胞白血病M3，14例正確，2例錯誤(表2)。圖2為決策樹模型3個差異性峰在白血病4種分型的比較。

圖1　決策樹診斷模型

分組例數準確率0組(16例)1組(18例)2組(14例)3組(16例)0組1675.000120401組18100.000018002組1471.429201023組1687.50020014

注：0組為急性粒細胞白血病M2a，1組為慢性粒細胞白血病，2組為急性淋巴細胞白血病，3組為急性粒細胞白血病M3。

注：橫坐標為蛋白質峰質荷比，縱坐標為蛋白質峰強度

圖2m/z為3 376、8 055及9 421蛋白峰表達差異的比較

討論

目前，國內、外在白血病分型診斷從細胞水平進展到分子水平，但僅依靠形態學、免疫組化、遺傳學、分子生物學等，未達到理想檢出率。

蛋白質反映了一個細胞真實狀態，且差異蛋白質表達更有助于鑒定健康和疾病狀態。蛋白組學研究能表現一個既定細胞的所有或特定蛋白質表達特征。分析蛋白質的改變不僅可直接獲得功能相關的標志物，且更適于標準化和臨床應用[5]。近年，蛋白組學結合質譜技術鑒定腫瘤生物標志物的嘗試結果讓人們看到了希望，給腫瘤標志物的研究帶來新的思維模式。傳統的研究方式一次只能分析一個單個的生物標志物，而蛋白組學結合質譜技術可一次獲得上百個蛋白質譜峰，通過一定的分析處理，建立決策樹診斷模型，使得多個生物標志物聯合檢測診斷疾病或疾病的分型成為可能[6-7]。

蛋白質指紋圖譜技術是繼基因芯片技術之后新一代生物芯片技術，已成為當前臨床蛋白質組學結合質譜技術研究中較為理想技術平臺，其診斷具有快速、早期、簡便、準確、靈敏等特點。在國內、外已有利用蛋白質指紋圖譜技術診斷胃癌、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的報道[8-12]，也取得了重大的突破。ADAM等[13]發現，蛋白質指紋圖譜技術不僅能正確區分前列腺癌、前列腺肥大與正常前列腺，而且能從存放5年的前列腺癌患者臨床發病前血清中檢出與前列腺癌相關的標志物。2013年浙江大學應用蛋白質指紋圖譜技術，建立了肺結核癥候分型蛋白決策診斷模型。

本研究通過對16例急性粒細胞白血病M2a、18例慢性粒細胞白血病、14例急性淋巴細胞白血病及16例急性粒細胞白血病M3檢測分析，用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0軟件進行標記物比較判別，建立由m/z為3 376、8 055、9 421決策樹模型，對白血病4種分型的檢出率均在70%以上。(4種類型白血病，單從形態上就能區分大多數類型，結合細胞化學、免疫組織化學基本上均能做出正確的鑒別診斷，不知道蛋白質指紋的價值究竟在哪兒？能否對未明確診斷的白血病也進行相關的研究，以發現其價值？)。

隨著生活水平的不斷提高，人們對身體的健康越來越重視，利用蛋白質譜技術對體驗人群進行指紋圖譜的分析也成為趨勢，本研究也通過健康對照樣本和白血病樣本進行標記物比較判別，發現白血病樣本有22個差異顯著的蛋白峰。由于研究樣本例數較少，對此模型診斷效能的穩定性有待在今后的研究中進一步擴大樣本數對模型進行驗證，并從分子生物學水平分析研究模型中標記蛋白的性質，證實這些標記蛋白與白血病的關聯性，一旦建立起穩定的診斷模型，依據其標記蛋白表達的高、低，可以在臨床發病前預測其是否會發展成為白血病，對可能患病的人群加強監護和預防性治療，真正發揮SELDI-TOF-MS技術在臨床醫學中的作用，使白血病的早期發現、早期治療變為可能。

本研究建立了白血病4種分型的蛋白質指紋圖譜診斷模型，具有較高的診斷效能。由于研究樣本例數較少，且只針對急性粒細胞白血病M2a、慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血病M3這4種白血病分型。因此，在今后的研究中還需擴大樣本數，進一步完善不同類型白血病之間的鑒別診斷，并從分子生物學水平分離分析研究模型中標記蛋白的性質，證實這些標記蛋白與白血病不同分型的關聯性，希望能建立不同臨床分型的白血病診斷模式以指導臨床診療，為白血病的臨床診斷研究提供新的思路和方法。

參考文獻

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(本文編輯：儲怡星)