慢性腎小球腎炎患者外周血Th1/Th2及CD28+細胞的變化及其臨床意義

周韻嬌，　李　鵬，　張麗紅，　錢英俊，　牛建英

(1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院中心實驗室，上海 200240；

2.復旦大學附屬上海市第五人民醫院腎內科，上海 200240)

慢性腎小球腎炎患者外周血Th1/Th2及CD28+細胞的變化及其臨床意義

周韻嬌1，李鵬2，張麗紅2，錢英俊2，牛建英2

(1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院中心實驗室，上海 200240；

2.復旦大學附屬上海市第五人民醫院腎內科，上海 200240)

摘要：目的探討慢性腎小球腎炎(CGN)患者外周血Th1/Th2及CD28+細胞百分率的變化在疾病進程中可能的細胞免疫學機制。方法采用流式細胞術檢測50例CGN患者及30名正常人(對照組)外周血Th1/Th2和CD28+細胞的百分率，用SPSS 16.0軟件對試驗結果進行統計分析。結果與對照組比較，CGN患者外周血CD3+CD4+細胞百分率和CD4/CD8比值明顯降低(P<0.05)，Th1和Th2細胞百分率差異無統計學意義(P>0.05)，但Th1/Th2比值明顯增高(P<0.05)；CGN患者CD28+、CD4+CD28+細胞百分率明顯減少(P均<0.01)。結論CGN患者體內T細胞免疫功能紊亂和活化受限，細胞免疫功能低下，Th1和Th2細胞失衡，通過對CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+細胞的檢測，有助于了解患者的細胞免疫狀態，為臨床診斷和免疫治療提供參考依據。

關鍵詞：Th1/Th2細胞；CD28+細胞；流式細胞術；慢性腎小球腎炎

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0141-04R446.63

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.009

Abstract:ObjectiveTo investigate the possible mechanism of cellular immunology in the process of chronic glomerulonephritis (CGN) by the detection of Th1/Th2 ratio and CD28+cell percentages from peripheral blood in patients with CGN. MethodsTh1/Th2 ratio and CD28+cell percentages were detected by flow cytometry from 50 patients with CGN and 30 healthy subjects (control group). SPSS 16.0 software was used to analyze the results. ResultsCompared with control group, the percentages of CD3+CD4+cells and CD4/CD8 ratio of patients with CGN decreased significantly (P<0.05). Although there was no statistical significance in the percentages of Th1 and Th2 cells (P>0.05), yet Th1/Th2 ratio increased significantly (P<0.05). The percentages of CD28+and CD4+CD28+cells decreased significantly (P<0.01). ConclusionsT cell immune function is disorder, and activation is restricted in patients with CGN. Their cellular immune function is low, and there exists imbalance between Th1 and Th2 cells. The detection of Th1/Th2 ratio and percentages of CD28+cells from peripheral blood in patients with CGN is valuable to understand the immune state so as to provide the theoretical basis for immune therapy.

基金項目：閔行區科委自然基金項目(2010MHZ027)

作者簡介：周韻嬌，女，1981年生，碩士，主管技師，主要從事細胞免疫研究工作。

通訊作者：牛建英，聯系電話：021-64308151。

收稿日期：(2014-02-25)

The variation and its clinical significance of Th1/Th2 and CD28+cells from peripheral blood in patients with chronic glomerulonephritisZHOUYunjiao1,LIPeng2,ZHANGLihong2,QIANYingjun2,NIUJianying2.(1.CentralLaboratory,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China; 2.DepartmentofNephrology,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China)

Key words: Th1/Th2 cell; CD28+cell; Flow cytometry; Chronic glomerulonephritis

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是引起腎功能衰竭的主要病因，其發病機制復雜，不僅與體液免疫有關，而且免疫活性細胞也參與了疾病的發生和發展。作為免疫炎癥性腎病，體液免疫在CGN發病及進展中的機制已經得到了廣泛而深入的研究和證實，而關于CGN細胞免疫方面的研究較少。T淋巴細胞是機體細胞免疫的重要指標，在CGN的發生與發展中起著重要的作用，而T細胞的活化是其發揮免疫效應的基礎。本研究通過觀察50例CGN患者外周血Th1/Th2細胞比值及共刺激分子CD28的水平，探討Th1/Th2細胞比值及共刺激分子CD28的變化在CGN進展過程中可能的細胞免疫學機制，為臨床診斷和尋找有效、合理的治療手段提供線索和思路。

材料和方法

一、研究對象

收集上海市第五人民醫院CGN患者50例，其中男30例，女20例，年齡(55.06±15.71)歲，診斷符合“1992年《中華內科雜志》編委會腎病專業組“原發性腎小球疾病分型與治療及診斷標準”[1]，排除繼發性腎小球疾病、合并感染及其它自身免疫性疾病，所有病例半年內未使用糖皮質激素和免疫抑制劑等治療。對照組為上海市第五人民醫院同期體檢健康者，共30名，其中男18名，女12名，年齡(52.67±13.42)歲，無自身免疫性疾病或遺傳性疾病家族史。

二、 試劑和儀器

1.試劑雙色淋巴細胞亞群分析試劑盒[抗體組成為CD3/CD4、CD3/CD8、IgG1/IgG2a，均為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)雙色標記]、CD3-多甲藻葉綠素蛋白(multivalent algal chlorophll protein, PerCP)、CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE、白細胞介素4(interleukin4, IL-4)-PE、干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG2b-PE均為Becton-Dickinson(美國)公司產品，溶血素、固定破膜劑和標準熒光微球為Beckman Coulter公司生產，佛波醇酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、莫能霉素(monensin)、離子霉素(ionomycin)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)均為Sigma公司(美國)產品，RPMI1640、胎牛血清、青鏈霉素均為GIBCO公司(美國)產品，無水甲醇為國藥集團(中國)生產。

2.儀器Beckman Coulter Epics XL流式細胞分析儀(美國)，Thermo Forma公司(美國)CO2培養箱，Eppendorf 5702低速離心機(德國)。

三、 方法

1.樣本采集 所有研究對象于清晨空腹靜脈采血2 mL(肝素抗凝),充分顛倒混勻，用于流式細胞術分析。

2.T細胞亞群及CD28+細胞的檢測采用流式細胞術檢測所有研究對象外周血中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+細胞百分率。

四、 統計學方法

結果

一、CGN組和對照組外周血T淋巴細胞亞群

與對照組比較，CGN患者CD3+CD4+細胞百分率和CD4/CD8比值降低(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+細胞百分率差異均無統計學意義(P>0.05)；Th1/Th2比值增高(P<0.05)，但Th1和Th2細胞百分率差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1CGN患者與對照組外周血T細胞亞群結果比較

組別 CD3+(%)CD3+CD4+(%)CD3+CD8+(%)Th1(%)Th2(%)CD4/CD8Th1/Th2對照組65.69±6.3837.43±5.0723.50±7.249.90±3.121.45±0.591.85±1.007.62±2.91CGN組63.46±7.3734.65±5.53*27.28±8.8111.51±3.931.30±0.371.47±0.72*9.67±5.15*

注：與對照組比較，*P<0.05;CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞百分率用占淋巴細胞總數的百分比表示，Th細胞百分率用占CD3+細胞的百分比表示

二、CGN組和對照組外周血CD28+細胞

與對照組比較，CGN患者CD28+和CD4+CD28+細胞百分率明顯降低(P均<0.01)，CD8+CD28+細胞百分率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2CGN患者與對照組外周血CD28+細胞

百分率結果比較

組別 CD28+CD4+CD28+CD8+CD28+對照組56.69±6.8234.04±4.878.35±3.47CGN組50.54±5.59*30.58±5.30*9.50±2.53

注：與對照組比較，*P<0.01；CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+細胞用占CD3+細胞的百分比表示

討論

CGN是一種病程遷延、緩慢、進行性發展的慢性腎病，以往對CGN免疫病理機制的研究較集中于細胞因子網絡，由其介導的免疫反應在疾病進展中的機制也已經得到了公認[2-3]，而對免疫活性細胞在疾病進展中的機制研究較少，但它卻在CGN的整個病程中發揮著重要的作用[4-5]。

淋巴細胞是人體內最主要的免疫活性細胞，正常情況下，機體通過淋巴細胞亞群間的相互作用維持正常的免疫功能，某一亞群數量或功能的異常，均會導致機體的免疫紊亂，出現一系列的病理改變。T細胞是淋巴細胞中的主要細胞亞群，是細胞免疫和免疫調節的主要執行者，其數量和活性的改變是機體細胞免疫狀態的重要指標。CD4+和CD8+細胞是T淋巴細胞的2個亞群，兩者形成的T細胞網絡維持并調節體內免疫功能的平衡，任何原因引起的CD4+或CD8+細胞數量的升高或降低都會使兩者比例失調，導致機體免疫功能的異常或紊亂，從而出現自身免疫性疾病。

CGN作為一種感染引發的自身免疫性疾病，細胞免疫在疾病的發生、發展過程中發揮著重要的作用，腎纖維化患者出現大量的CD4+T淋巴細胞浸潤[6]。為了深入探討細胞免疫介導的CGN的可能發病機制，本研究采用流式細胞術檢測了50例CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+細胞的百分率。為了獲得更準確和可靠的試驗結果，檢測前，采用標準熒光微球對儀器進行光路校準。試驗結果顯示，與對照組相比，CGN患者CD3+CD4+細胞百分率和CD4/CD8比值明顯降低，CD3+CD8+細胞百分率雖有增多趨勢，但差異無統計學意義。CD3+CD4+細胞百分率的降低導致CD4/CD8比值的變化，說明CGN患者存在T細胞亞群失衡，機體細胞免疫功能紊亂，CD3+CD4+細胞是引起T細胞亞群失衡的主要因素，該結果證實了已有的報道[4]。

CD4+T細胞根據產生的細胞因子和功能不同可以分為Th1和Th2亞群，Th1具有促進細胞免疫和免疫調節的作用，其效應反應失調會導致細胞免疫介導的器官特異性自身免疫性疾病，Th2具有增強體液免疫和免疫調節的作用，2種細胞比例的失調與自身免疫性疾病的發病密切相關。本研究以CD4+IFN-γ+和CD4+IL-4+分別作為Th1和Th2細胞的標志，結果顯示，CGN 患者Th1和Th2細胞百分率較對照組分別有增多和減少的趨勢，但差異無統計學意義，而Th1/Th2比值較對照組增高。該結果說明CGN患者存在Th1/Th2平衡失調，機體內環境的穩定性遭到破壞，這可能與CGN患者細胞免疫功能的異常和細胞介導的免疫病理過程有關。

細胞免疫應答的中心環節是T細胞對抗原的識別和有效激活，這是一個由多因素參與的復雜的生物學過程，有賴于共刺激分子提供協同刺激信號，從而調節機體免疫功能。在這一過程中，CD28和B7分子分別作為受體和配體，在T細胞的活化和增殖中起主導作用[7]。CD28分子持續表達于T淋巴細胞表面[8]，與表達在抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)上的B7分子結合，為識別APC提呈的特異性抗原后的初始T細胞提供協調刺激信號，促進T細胞活化和增殖，增強免疫應答[9]。此外，CD28/B7還參與調節Th細胞的分化，CD28分子與B7的相互作用，促進Th2細胞分化，間接抑制Th1的分化[10-11]。有研究表明，CD28+細胞參與了終末期腎臟病患者的疾病進程，接受腹膜透析的患者，CD4+CD28null細胞較健康對照組明顯增多[12-13]。

本研究結果顯示，CGN患者CD28+、CD4+CD28+細胞百分率較對照組明顯減少，CD8+CD28+細胞百分率差異無統計學意義。CD28分子作為T細胞活化和耐受的關鍵調節分子，在Th(CD4+)細胞上的表達低下，說明CGN患者Th細胞的活化受到限制，從而不能產生有效的細胞免疫應答，導致CGN患者細胞免疫功能低下，體液免疫也因此受累。由于CGN患者CD28+細胞百分率的降低，無法產生足夠的信號促進Th2細胞的分化，間接促進了Th1細胞的分化。Th1細胞通過分泌相應的細胞因子啟動并促進了腎組織的炎癥，從而加重腎臟的損傷。

綜上所述，CGN患者存在細胞免疫功能紊亂和T細胞亞群失衡，CD3+CD4+細胞是引起該失衡的主要因素，Th1/Th2平衡失調可能與細胞介導的免疫病理過程有關；CGN患者T細胞活化受抑，導致細胞免疫功能低下。通過對CGN患者外周血Th1/Th2和CD28+細胞的檢測，有助于了解體內細胞免疫狀態，對病情的判斷和預后有一定的臨床參考價值，為免疫治療提供理論依據。

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(本文編輯：姜敏)