饑餓對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達(dá)的影響

褚迎欣，張建凱，程光，張樹波，高曉增，劉鐵軍，張小平(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

饑餓對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達(dá)的影響

褚迎欣，張建凱，程光，張樹波，高曉增，劉鐵軍，張小平
(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

摘要:目的觀察饑餓對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3( LC3)、Beclin 1自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法將70只SD大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組10只、短期組30只(饑餓1、2、3 d各10只)、長(zhǎng)期組30只(饑餓5、7、9 d各10只)。對(duì)照組正常飲食，短期組和長(zhǎng)期組均采取全饑餓處理。對(duì)照組于饑餓起點(diǎn)、短期組與長(zhǎng)期組分別于相應(yīng)饑餓終點(diǎn)斷頭取腦，采用Western blot法檢測(cè)大腦皮質(zhì)的LC3與Beclin 1。結(jié)果短期組饑餓3 d大腦皮質(zhì)LC3 與Beclin 1較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)( P＜0.05、0.01)，長(zhǎng)期組較對(duì)照組及短期組大腦皮質(zhì)LC3與Beclin 1表達(dá)上調(diào)( P均＜0.01)。短期組饑餓1 d與2 d時(shí)大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1表達(dá)比較，P均＞0.05;長(zhǎng)期組饑餓7 d與9 d時(shí)大腦皮質(zhì)Beclin 1表達(dá)比較，P＞0.05。結(jié)論短期饑餓2 d內(nèi)大鼠大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1表達(dá)未發(fā)生明顯改變，隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠大腦皮質(zhì)LC3與Beclin 1表達(dá)上調(diào)。

關(guān)鍵詞:自噬;饑餓;大腦皮質(zhì);微管相關(guān)蛋白1輕鏈3;自噬相關(guān)蛋白

自噬是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過(guò)程的統(tǒng)稱，自噬體形成是其過(guò)程中一重要階段［1］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3( LC3)是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白［2］，Beclin 1在自噬體形成過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［3］，二者的表達(dá)變化可在某種程度上反映自噬的激活。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，營(yíng)養(yǎng)缺乏是自噬發(fā)生的激活劑［4，5］。機(jī)體對(duì)饑餓狀態(tài)代謝反應(yīng)的整體調(diào)節(jié)是復(fù)雜變化的，自噬本身也是一個(gè)隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。腦作為神經(jīng)中樞，其對(duì)饑餓引起的應(yīng)激反應(yīng)具有特殊性。2013年9月～2014年12月，我們觀察了饑餓對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料3月齡健康雄性SPF級(jí)SD大鼠70只，體質(zhì)量330～370 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào): SCXK-(軍) 2009-003］。于室溫20～24℃、相對(duì)濕度45%～55%、通風(fēng)良好、12 h晝夜節(jié)律、氨濃度＜14 mg/m3條件下，用標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。兔抗大鼠LC3多克隆抗體( MBL公司，日本)，兔抗大鼠Beclin 1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SP-9001免疫組化檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司) ; BX61金相研究級(jí)正立顯微鏡( Olympus公司，日本)，蛋白電泳儀、濕電轉(zhuǎn)膜儀( Bio-RAD公司，美國(guó))。

1.2動(dòng)物分組與處理將70只大鼠單籠飼養(yǎng)1周，以體質(zhì)量作為分層因素隨機(jī)分為對(duì)照組10只、短期組30只(饑餓1、2、3 d各10只)和長(zhǎng)期組30 只(饑餓5、7、9 d各10只)。對(duì)照組正常飲食，短期組和長(zhǎng)期組采取全饑餓處理(無(wú)飼料供應(yīng)，自由飲水)。以饑餓開始當(dāng)日上午8時(shí)作為饑餓起點(diǎn)，以饑餓時(shí)間達(dá)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的上午8時(shí)作為饑餓終點(diǎn)。對(duì)照組于饑餓起點(diǎn)、短期組與長(zhǎng)期組于相應(yīng)饑餓終點(diǎn)，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，斷頭取腦，迅速分離出大腦皮質(zhì)，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3大鼠大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1表達(dá)檢測(cè)采用Western blot法。取低溫凍存的腦組織，切碎后置于玻璃勻漿器中。根據(jù)組織凈重，按1∶10加入相應(yīng)體積預(yù)冷的裂解液;冰浴研磨勻漿，靜置至充分裂解; 4℃12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，沸水中變性5 min。每孔總蛋白上樣50 μg，行SDSPAGE凝膠電泳;將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜10 min×3次; 5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h后，加入兔抗大鼠LC3一抗( 1∶1 000)、兔抗大鼠Beclin 1一

抗( 1∶500)，以β-actin作為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗( 1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜20 min×3次。向膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑并使之與膜充分接觸1 min，暗室曝光、顯影、定影，圖像掃描。采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度比值作為L(zhǎng)C3、Beclin 1相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用雙向分類的方差分析，多重比較選用Dunnett-t檢驗(yàn)與LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

三組大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，見表1。

表1　三組大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1　三組大腦皮質(zhì)LC3、Beclin 1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與短期組比較，ΔP＜0.01。

組別　n LC3　Beclin 1短期組饑餓1 d　 5　0.20±0.03　0.22±0.03饑餓2 d　 5　0.22±0.04　0.23±0.04饑餓3 d　 5　0.36±0.06*　0.40±0.06#長(zhǎng)期組饑餓5 d　 5　0.80±0.08#Δ　0.65±0.08#Δ饑餓7 d　 5　1.41±0.08#Δ　1.11±0.10#Δ饑餓9 d　 5　1.63±0.09#Δ　1.05±0.11#Δ對(duì)照組5　0.19±0.03　0.20±0.03

3　討論

生理狀態(tài)下，細(xì)胞自噬保持在一個(gè)較低的水平，主要用于清除衰老或損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化。在營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及胞內(nèi)病原菌感染等應(yīng)激情況下，自噬增強(qiáng)。饑餓條件下，自噬可降解胞內(nèi)物質(zhì)，產(chǎn)生代謝中間產(chǎn)物以滿足細(xì)胞需求，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［8］。

自噬過(guò)程由一系列自噬相關(guān)基因( Atg)編碼的對(duì)應(yīng)蛋白參與完成，LC3是酵母Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源物，細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的存在形式主要有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種。LC3-Ⅰ散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在自噬體形成階段，LC3-Ⅰ與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ; LC3-Ⅱ穩(wěn)定地定位在自噬體的內(nèi)外膜上，直到自噬體與溶酶體融合后，被溶酶體水解酶降解［9］。在Western blot檢測(cè)中，LC3-Ⅱ與抗體的結(jié)合能力強(qiáng)于LC3-Ⅰ，即LC3-Ⅱ的檢測(cè)敏感性高于LC3-Ⅰ［10］。本研究結(jié)果顯示，短期組饑餓1、2 d者較對(duì)照組大腦皮質(zhì)LC3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明短期饑餓處理2 d內(nèi)大腦皮質(zhì)自噬體數(shù)量未發(fā)生明顯變化。Mizushima等［11］研究顯示，饑餓誘導(dǎo)24、48 h，在小鼠的肝臟等大部分組織器官中可觀察到自噬的激活，但在大腦、小腦中未觀察到自噬水平的升高。本研究結(jié)果與之一致，提示饑餓對(duì)自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)存在組織器官特異性。此外，饑餓初期，在機(jī)體代謝的整體調(diào)節(jié)下，肝糖原分解增加，且肝細(xì)胞發(fā)生自噬，降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì);肝糖異生增加在一定程度上維持了腦組織的能量供應(yīng)［12］，致使腦組織中對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量缺乏敏感的mTORC1與AMPK等自噬通路［13～15］的相關(guān)調(diào)控信號(hào)水平未發(fā)生明顯改變。本研究進(jìn)一步觀察結(jié)果顯示，長(zhǎng)期組較對(duì)照組及短期組LC3表達(dá)上調(diào)。表明隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬體水平增高。然而，長(zhǎng)期饑餓狀態(tài)下大鼠大腦皮質(zhì)自噬體數(shù)量顯著增多，可能與自噬體生成的增多和(或)自噬體降解減少有關(guān)。

Beclin 1是酵母Atg6基因在哺乳動(dòng)物中的同源物［16］。Beclin 1蛋白可通過(guò)與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶( Vps34)形成復(fù)合物參與自噬，且Beclin 1/Vps34復(fù)合物可作為一種招募平臺(tái)使其他Atg蛋白定位于前自噬體而促進(jìn)自噬體的形成。內(nèi)源性的Beclin 1定位于反面高爾基網(wǎng)、線粒體、核周膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［17］。研究表明，Beclin 1具有Bcl-2結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BH3結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞核輸出信號(hào)( NES)等5個(gè)結(jié)構(gòu)域［18］。其中，Bcl-2與Beclin 1相互作用并干擾Vps34和Beclin 1形成復(fù)合物;而NES可將Beclin 1從細(xì)胞核運(yùn)送到胞質(zhì)中，并以這種胞質(zhì)形式調(diào)節(jié)自噬［19］。本研究結(jié)果顯示，短期組饑餓1、2 d較對(duì)照組Beclin 1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，饑餓3 d表達(dá)上調(diào)，長(zhǎng)期組較對(duì)照組及短期組Beclin 1表達(dá)上調(diào)。饑餓條件下Bcl-2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致Bcl-2與Beclin 1之間的相互作用下降［20］，也可刺激自噬。須注意的是，本研究長(zhǎng)期組饑餓9 d與饑餓7 d比較，Beclin 1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但LC3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示長(zhǎng)期饑餓狀態(tài)下，自噬功能發(fā)生紊亂，如長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)與能量缺乏可造成溶酶體、線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致自噬溶酶體降解能力下降，使自噬體出現(xiàn)蓄積。

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收稿日期:( 2015-03-27)

通信作者:張小平

文章編號(hào):1002-266X( 2015)30-0023-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R363

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.008