胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA表達變化及意義

黃克楠，劉冬艷，王愛民，白志超，崔保栓，殷培培，馬良(中國人民解放軍第二五二醫院，河北保定071000)

胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA表達變化及意義

黃克楠，劉冬艷，王愛民，白志超，崔保栓，殷培培，馬良
(中國人民解放軍第二五二醫院，河北保定071000)

摘要:目的觀察胃癌組織中微小染色體維持蛋白2( MCM2) mRNA和增殖細胞核抗原( PCNA) mRNA的表達變化。方法應用實時定量PCR檢測48例份胃癌組織(觀察組)及其相應癌旁組織(對照組)中MCM2、PCNA mRNA，分析胃癌組織中兩者的表達與臨床病理參數的關系。結果觀察組、對照組MCM2 mRNA相對表達量分別為16.27±0.368、5.32±0.401，PCNA mRNA相對表達量分別為22.12±0.289、7.88±0.374，兩組比較，P均＜0.05。不同分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結轉移腫瘤組織中MCM2、PCNA mRNA表達比較，P均＜0.05。胃癌組織中MCM2 mRNA與PCNA mRNA的表達呈正相關( r = 0.531，P＜0.01)。結論胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA的表達增多，兩者可能與胃癌的發生發展有關。

關鍵詞:胃腫瘤;微小染色體維持蛋白2;增殖細胞核抗原

胃癌是臨床最常見惡性腫瘤之一，盡管近年來在世界范圍內的發病率有所下降，但其病死率在腫瘤中位居第二位［1］。胃癌的發生發展是一個多基因、多因素、多階段的動態順序演變過程，涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細胞周期的改變等。目前，我國首次就診的胃癌患者中有超過一半的患者已為中晚期。腫瘤的浸潤和轉移是胃癌治療后復發或進展的主要原因，因此，如何早期發現并診斷胃癌顯得尤為重要。微小染色體維持蛋白( MCM)為真核生物DNA復制的主要調控因子之一，其成員MCM2在靜止期細胞中不表達，在增殖細胞中過度表達，可以準確反映細胞的增殖活性，可作為細胞增殖標記物來標記細胞所處的狀態［2］。研究［3］表明，MCM2的細胞表達陽性率與細胞的增殖能力和進入細胞周期的細胞數成正相關，且與細胞發育異常的嚴重程度有關。增殖細胞核抗原( PCNA)是一種非組蛋白性的核蛋白，與細胞增殖和DNA合成有關，可反映細胞增殖程度和所處周期。本研究觀察了胃癌組織MCM2、PCNA mRNA的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2010年1月～2011年10月經病理確診的48例胃癌患者，其中男31例、女17例，年齡26～81歲，中位年齡60歲。臨床分期中Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期31例，Ⅳ期(大網膜浸潤) 1 例;腫瘤直徑＞5 cm 23例，≤5 cm 25例;高分化腺癌12例，低分化腺癌25例，中分化腺癌11例; T分期中T1期6例，T2期16例，T3期21例，T4期5例。所有患者術前均未行放化療，手術切除胃癌組織作為觀察組，并選取其對應的距胃癌邊緣3 cm的癌周組織及陰性切緣組織作為對照組。

1.2 MCM2、PCNA mRNA檢測方法采用實時定量PCR。兩組組織標本離體后立即置于液氮罐冷凍，后轉移至－80℃(冰箱)下保存待檢。采用TRIzol(康為世紀生物工程有限公司)一步法抽提組織總RNA。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。紫外分光光度儀測定RNA的量，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。所提取RNA于－80℃冷凍保存。使用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀生物工程有限公司)進行逆轉錄反應。取總RNA提取物2 μL，dNTP Mix 4 μL( 2.5 mmol/L Each)，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，SuperRT 酶1 μL( 200 U/μL)，RNase-Free Water 7 μL。反應體系共20 μL，混勻，42℃35 min，85℃5 min，反應產物置于－20℃長期保持。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。MCM2基因引物序列:上游為5'-CACATCGAGTCCATGATCC-3'，下游為5'-CAAAAGTCTTGCGCATGCT-3'，基因片段長度為113 bp; PCNA基因引物序列:上游為5'-GGAAATGGAAACATTTTAAATTGTCAC-3'，下游為5'-GAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAG-3'，基因片段長度為133 bp; GAPDH引物序列:上游為5'-AGCCT-

CAAGATCATCAGCAATGCC-3'，下游為5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3'，基因片段長度為293 bp。樣品在ABI7500型熒光PCR儀上進行擴增。采用相對定量法，在測定目的基因的同時測定內源性看家基因GAPDH，用以標準化標本。取cDNA 0.5 μL，依次加入2×Buffer 12.5 μL，Super Enzyme Mix 0.5 μL，上下引物各0.5 μL，反應體系為25 μL。反應條件為45℃10 min; 95℃5 min; 95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環;每一例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值。以GAPDH為參照基因，檢測各模板的Ct值，陰性對照不加模板。溶解曲線為單峰表示基因特異性擴增。目的基因mRNA的相對表達量以2ΔCt表示。

1.3統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗;兩變量間的相關性檢驗采用Spearman等級相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

觀察組、對照組MCM2 mRNA相對表達量分別為16.27±0.368、5.32±0.401，PCNA mRNA相對表達量分別為22.12±0.289、7.88±0.374，兩組比較，P均＜0.05。MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌患者臨床病理因素的關系見表1。不同分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結轉移腫瘤組織中MCM2、PCNA mRNA表達比較，P均＜0.05。胃癌組織中MCM2 mRNA與PCNA mRNA的表達呈正相關( r = 0.531，P＜0.01)。

表1　 MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌臨床病理參數的關系(±s)

表1　 MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌臨床病理參數的關系(±s)

臨床病理參數MCM2 mRNA　PCNA mRNA分化程度高、中分化　11.26±0.223　 10.21±0.184低分化　15.84±0.365　 17.68±0.398臨床分期Ⅰ～Ⅱ期　5.68±0.136　6.42±0.273Ⅲ～Ⅳ期　26.84±0.431　 27.19±0.372 T分期T1～T2期　5.67±0.257　7.81±0.314 T3～T4期　20.82±0.412　 23.54±0.563腫瘤直徑＜5 cm　11.26±0.384　 10.99±0.267 ≥5 cm　19.44±0.352　 18.38±0.209淋巴結轉移無3.91±0.076　4.35±0.153 有18.47±0.238　 19.24±0.364

3　討論

MCM是1998年發現的微小染色體支持蛋白，由6個亞基構成的六聚體環狀蛋白質，即MCM2～7，由cdc基因編碼。目前一致認為，它們是一組在序列上高度同源，功能上密切相關的蛋白。MCM是真核生物DNA復制的必需因子，是DNA復制許可因子，在DNA復制起始與延伸中起關鍵作用，能確保DNA的復制在每個細胞周期中僅發生一次［4］。在G1期，MCM結合到DNA形成復制前復合體，MCM2是該復合體中的一種。MCM2在靜止期細胞中含量極少，在正常增殖細胞和轉化細胞中的含量在G1期開始增加，S期早期達到高峰，并與染色質結合，在S期至有絲分裂期是游離的，在G2期與M期時降低。MCM2與細胞周期變化相一致，為細胞S期的標志物，是特異性增殖相關因子，被認為是癌前標記，廣泛應用于腫瘤早期診斷［5］。

MCM2在多種腫瘤組織中均有不同表達，且MCM2高表達與腫瘤的分化、分期、預后相關。Wojnar等［6］發現MCM2表達與乳腺癌組織分化程度有關，腫瘤分化越差，MCM2陽性率越高。Saeb-Parsy等［7］對497例膀胱癌患者尿液脫落細胞進行了研究，認為免疫組化法檢測MCM2可作為診斷膀胱癌可重復使用的方法。Rosamilia等［8］研究發現，MCM2蛋白在正常宮頸上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中的陽性表達率逐漸增加。Negri等［9］用免疫組化法檢測15例宮頸腺癌及29例宮頸原位腺癌的MCM2蛋白，發現檢測MCM2有助于診斷宮頸腺癌。

本研究結果顯示，MCM2 mRNA在胃癌組織中的表達高于其對應的癌旁組織，且MCM2 mRNA在不同腫瘤分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結轉移中的表達具有差異性，提示MCM2 mRNA可作為胃癌早期診斷及預后判斷的重要指標。本實驗還同時檢測了相應組織中PCNA mRNA的表達，結果顯示MCM2 mRNA與PCNA mRNA在胃癌組織中的表達呈正相關。提示兩者在細胞周期調控中共同參與了胃癌的發生、發展。

綜上所述，胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA的表達增多，兩者可能與胃癌的發生發展有關，兩者聯合檢測可用于輔助胃癌早期診斷、病情評估及預后判斷。

參考文獻:

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［5］Shomori K，Nishihara K，Tamura T，et al.Geminin，Ki67，and minichromosome maintenance 2 in gastric hyperplastic polyps，adenomas，and intestinal-typecarcinomas: pathobiological significance ［J］.Gastric Cancer，2010，13( 3) : 177-185.

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收稿日期:( 2015-05-13)

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0069-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.028