側腦室注入網膜素對小鼠攝食量及其下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達的影響

宋娟，孫燕妮，秦熠，郭瑞敏，承解靜(上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200062)

側腦室注入網膜素對小鼠攝食量及其下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達的影響

宋娟，孫燕妮，秦熠，郭瑞敏，承解靜
(上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200062)

摘要:目的觀察側腦室注入網膜素( omentin)對小鼠攝食量及其下丘腦組織神經肽Y( NPY)、刺鼠相關蛋白( AGRP)、促腎上腺皮質激素釋放激素( CRH)、阿片-促黑素細胞皮質素原( POMC) mRNA表達的影響。方法20只昆明小鼠隨機分為實驗組及對照組，兩組側腦室置管并保留72 h后分別于側腦室注射omentin及生理鹽水( 1.2 μg/kg)，觀察注射后24 h小鼠攝食量有無變化，RT-PCR檢測兩組小鼠下丘腦組織AGRP、NPY、CRH及POMC mRNA。結果實驗組、對照組攝食量分別為( 4.63±0.17)、( 4.51±0.12) g，兩組比較，P＞0.05。實驗組、對照組NPY mRNA相對表達量分別為0.47±0.24、0.48±0.29，AGRP mRNA分別為24.31±6.21、22.01±7.14，POMC mRNA分別為0.92±0.48、0.83±0.16，CRH mRNA分別為0.93±0.45、0.69±0.12，兩組CRH mRNA表達量比較，P＜0.05。結論側腦室注入omentin對小鼠攝食量及下丘腦組織NPY、AGRP、POMC mRNA表達無影響，但CRH mRNA表達增加。

關鍵詞:網膜素;下丘腦食欲中樞;促腎上腺皮質激素釋放激素

脂肪組織是體內最大的能量儲備器官和內分泌器官，其分泌大量脂肪因子參與調節脂肪代謝、葡萄糖代謝及炎癥反應。脂肪因子除作用于外周組織，還通過控制攝食、影響食欲對能量代謝產生重要中樞調節作用。參與下丘腦食欲調節的基因包括神經肽Y( NPY)、刺鼠相關蛋白( AGRP)、促腎上腺皮質激素釋放激素( CRH)、阿片-促黑素細胞皮質素原( POMC)等。網膜素( omentin)是特異性表達于網膜脂肪組織的脂肪細胞因子，廣泛參與糖代謝、炎癥反應、血管功能等過程，在肥胖患者中水平下降。本實驗觀察了側腦室注入omentin對小鼠攝食量及下丘腦NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達的影響，進一步闡明omentin與肥胖的關系。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康昆明小鼠20只，雌雄各半，體質量25～30 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，置于室溫25℃左右，分籠喂養，12 h/12 h晝夜循環光照條件下生活，自由飲水。人重組omentin購自Sigma公司。

1.2 omentin小鼠側腦室注入方法將20只昆明小鼠飼養至7周齡后，隨機分為實驗組和對照組。兩組小鼠固定于腦立體定位儀上(復旦大學醫學院生物研究所提供)，腹腔注射戊巴比妥麻醉，碘酒消毒頭頂皮膚后，縱向正中切開顱頂皮膚，暴露顱骨，在前囟點后1 mm、中線旁開2 mm處，用牙科鉆鉆一小孔，垂直插入一個PE210塑料管(內徑0.128 mm，外徑0.161 mm)，深度為2 mm?？p合頭皮，將小管固定于頭顱。保留置管72 h，期間正常飲食。在第4天清晨7: 00至8: 00使用微量注射器于實驗組小鼠置管中注入omentin( 1.2 μg/kg)，對照組注入生理鹽水( 1.2 μg/kg)，均于30 s內完成。

1.3小鼠攝食量觀察及下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA檢測觀察注射后24 h兩組小鼠攝食量有無變化。24 h后用10%水合氯醛( 3 mL/kg)腹腔內注射致死小鼠，于無菌冰塊上迅速取出兩組小鼠的下丘腦組織，置液氮冷凍，然后置于－80℃超低溫冰箱保存，以備RNA提取。采用RT-PCR檢測下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA。按TRIzol試劑盒說明書提取下丘腦的總RNA，測定RNA濃度后在20 μL的反應體系中，以1 μL RNA為模板進行逆轉錄。自基因庫查得小鼠NPY、AGRP、CRH、POMC目的基因和β-actin的cDNA序列，設計PCR引物，擴增條件: 94℃、15 s，60℃、60 s，80℃、2 s，44個循環。所有基因擴增前95℃預變性10 min，擴增后72℃延伸10 min。反

應以β-actin作為內參，根據2－ΔΔCt法測定NPY、AGRP、POMC及CRH mRNA的相對表達量。

1.4統計學方法采用SPSS11.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

實驗組、對照組攝食量分別為( 4.63±0.17)、( 4.51±0.12) g，兩組比較，P＞0.05。兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達比較見表1。

表1　兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達比較(±s)

表1　兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別NPY mRNA AGRP mRNA POMC mRNA CRH mRNA實驗組　0.47±0.24　 24.31±6.21　 0.92±0.48 0.93±0.45*對照組0.48±0.29　 22.01±7.14　 0.83±0.16 0.69±0.12

3　討論

下丘腦是哺乳動物調控食欲的基本部位，其內存在食欲調節神經細胞群，構成弓狀核、腹內側核、室旁核、視交叉上核等，合稱為食欲中樞。由于弓狀核血腦屏障相對薄弱，故成為中樞與外周循環食欲因子交換信息的重要通路。弓狀核主要合成NPY、AGRP、POMC和α-促黑素。CRH主要由下丘腦室旁核的小細胞合成。其中NPY及AGRP為促食欲調節因子，而CRH及POMC為抑制食欲因子［1］。能量攝入與消耗的精細平衡是保持正常體質量的關鍵。脂肪組織分泌脂肪因子與下丘腦“對話”，通過控制攝食、影響食欲對能量代謝產生重要中樞調節作用。外周食欲調節因素可通過多種途徑參與食欲中樞的調節［2］。小鼠腦室和外周靜脈注射生長激素釋放肽( ghrelin)可強烈刺激小鼠食欲，減少能量消耗，且ghrelin增強食欲作用與增加AGRP的表達有關［3］。瘦素與受體結合作用于下丘腦飽食中樞，可抑制NPY的釋放，從而降低食欲;還可與POMC上的瘦素受體結合增加促黑激素的釋放，從而抑制進食［4］。研究［5］發現，脂聯素缺乏小鼠出現弓狀核區的AMPK磷酸化減弱、食物攝取減少等現象。

omentin是特異性表達于網膜脂肪組織的脂肪細胞因子［6］。在人類，omentin基因位于1q22-q23染色體區域，該區域與2型糖尿病有關。超重及肥胖者血漿omentin水平較正常體質量者降低，且血漿omentin水平與BMI、腰圍、瘦素水平、HOMA-IR呈負相關，與脂聯素及HDL-C呈正相關，且血漿omentin水平在體質量減輕后升高［7］。大鼠下丘腦注射omentin后其1 d的攝食量無顯著影響，同時AGRP、NPY、食欲素A、可卡因-安非他明調節轉錄肽( CART)、CRH及POMC基因表達無變化［8］。腹腔內注射omentin后10～14 d，大鼠的攝食量明顯增加，且自第12天開始大鼠的體質量顯著增加，CART及CRH基因表達下降［9］。

參考國外文獻，本研究中小鼠下丘腦注射劑量依據體表面積換算得出。本研究結果表明，向小鼠側腦室注射omentin后小鼠短期攝食量未發生改變，這可能與觀察時間較短有關。與既往研究［8，9］結果不同，本實驗小鼠側腦室注入omentin后下丘腦24 h CRH mRNA表達水平增加。CRH為抑制食欲因子，omentin引起CRH基因表達發生變化，這與肥胖者omentin水平降低的研究結果相一致。提示omentin具有中樞抑制食欲作用。食欲調節是一個非常復雜且精細的過程，需要諸多因子共同參與，omentin在中樞有無受體，其如何作用于CRH，是否與其他核團或神經遞質發生聯系，尚需進一步研究。

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［8］Brunetti L，Di Nisio C，Recinella L，et al.Effects of vaspin，chemerin and omentin-1 on feeding behavior and hypothalamic peptide gene expression in therat［J］.Peptides，2011，32( 9) : 1866-1871.

［9］Brunetti L，Orlando G，Ferrante C，et al.Orexigenic effects of omentin-1 related to decreased CART and CRH gene expression and increasednorepinephrine synthesis and release in the hypothalamus［J］.Peptides，2013( 44) : 66-74.

·臨床研究·

收稿日期:( 2015-06-18)

通信作者:承解靜

基金項目:上海市教委預算內科研項目( 2012JW65)。

文章編號:1002-266X( 2015)31-0037-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R338.27

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.014