缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經元細胞凋亡、脊髓組織中內質網應激經典標志物的表達變化

關鑫，董明巖，于洋，高博(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000)

缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經元細胞凋亡、脊髓組織中內質網應激經典標志物的表達變化

關鑫，董明巖，于洋，高博
(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000)

摘要:目的觀察缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經元細胞凋亡、脊髓組織中內質網應激經典標志物的表達變化，并探討其意義。方法將60只SD大鼠隨機分為實驗組、假手術組和空白組，各20只。實驗組采用經典Zivin法復制模型，動脈夾結扎左腎下腹主動脈1 h，制備脊髓缺血再灌注模型;假手術組只做左側肋骨下緣切口，不結扎腹主動脈;空白組不做任何處理。三組分別于缺血再灌注后6、12、24、48 h，電鏡觀察脊髓神經元細胞的凋亡情況，Western blotting法檢測脊髓組織X-盒結合蛋白1( XBP1)及C-JNK氨基末端激酶(磷酸化JNK)蛋白。結果與假手術組及空白組相比，實驗組缺血再灌注6、12、24、48 h神經細胞凋亡數量多。假手術組及空白組可檢測到少量表達的XBP1及磷酸化JNK蛋白。實驗組再灌注6 h后，缺血再灌注梗死灶周圍可以觀察到明顯表達的XBP1及磷酸化JNK蛋白，缺血再灌注12 h后兩種蛋白表達達到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達。結論缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經元細胞凋亡數量增加、脊髓組織中內質網應激經典標志物XBP1及磷酸化JNK蛋白的表達增加。內質網應激參與了脊髓缺血再灌注后的神經細胞凋亡，其機制可能與促進脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達有關。

關鍵詞:內質網應激;脊髓缺血再灌注; X-盒結合蛋白1; C-JNK氨基末端激酶

脊髓缺血再灌注損傷［1］在臨床上十分常見，以往認為缺血再灌注損傷的主要方式是細胞壞死，但最新研究發現缺血再灌注損傷的主要方式是由細胞的凋亡引起的。過去認為介導神經細胞調亡的途徑分別是線粒體途徑和死亡受體途徑［2］，近幾年發現內質網應激是介導神經細胞凋亡的新途徑。內質網的主要功能是合成蛋白質，并進行修飾、折疊，將加工后的成熟蛋白轉運出內質網［3］。內質網內環境必須維持在穩定平衡狀態，以保證蛋白質的最佳折疊狀態，這種平衡一旦遭到破壞將導致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網內聚集，即內質網應激［4］。本研究采用透射電鏡檢測脊髓神經細胞的凋亡情況，并應用Western blotting法觀察了大鼠脊髓缺血再灌注后不同時間點內質網應激經典標志物X-盒結合蛋白1( XBP1)及C-JNK氨基末端激酶(磷酸化JNK)蛋白的表達變化，并探討其意義。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康SD大鼠60只，雌雄不限，200～300 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器磷酸化JNK多克隆抗體、XBP1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司; SABC免疫組化試劑盒、DAB染色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司;無水乙醇;多聚甲醛;二甲

苯;石蠟切片機;生物研究顯微鏡( BM-E) ;顯微生物照相顯微鏡。

1.3大鼠脊髓缺血再灌注模型制備及分組所有大鼠適應性喂養1周，分籠飼養，術前8 h禁食水。采用單純隨機抽樣方法將所有大鼠分為實驗組、假手術組和空白組，每組20只。用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質量進行腹腔注射麻醉。實驗組大鼠均采用經典Zivin法復制模型，從大鼠左側肋骨下緣肋中線向下開口約3 cm，找到腹主動脈，用動脈夾夾閉1 h。1 h后松開動脈夾，檢查所有大鼠腹腔無滲血后，用慶大霉素8萬U沖洗腹腔，并逐層關腹。假手術組只做左側肋骨下緣切口，不結扎腹主動脈，1 h后逐層關腹?？瞻捉M不做任何處理。各組在模型制備后的6、12、24、48 h每個時間點取5只大鼠，沿劍突打開胸腔暴露其心臟，經左心室插管至主動脈內，剪開右心耳，灌流固定。灌注完畢，立即取腰膨大以下段脊髓組織，將其分別浸入4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛磷酸緩沖液中保存備用。

1.4各組大鼠脊髓神經細胞的凋亡情況觀察取出2.5%戊二醛磷酸緩沖液里的脊髓組織，將其切成約1 mm3的組織塊。再次浸入2.5%戊二醛中固定2 h，1%鋨酸固定2～3 h，常規梯度乙醇脫水后，純丙酮+包埋液( 2∶1)包埋，超薄切片，電鏡觀察神經細胞的凋亡情況并做各組凋亡細胞的定量分析。用投射電鏡先在低倍下辨認凋亡的神經細胞并將其分布按網孔繪于坐標紙上，在3 000倍下，拍攝每組各時間點照片，每個時間點20張，計算照片上凋亡神經細胞數量。

1.5各組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白檢測采用Western blotting法。直接快速取出各時間點的大鼠冰上腰膨大以下0.1 g脊髓，離心取上清液。充分變性蛋白，冷卻到室溫后，放入電泳裝置。電泳結束后轉膜。1∶400稀釋的XBP1一抗和1∶400稀釋的磷酸化JNK一抗4℃孵育過夜。1∶2 000稀釋的二抗在側擺搖床上緩慢搖動室溫孵育l h。運用Quantityone4.6.2( Bio.Rad，美國)凝膠圖像分析系統對結果進行光密度掃描分析。

1.6統計學方法采用SPSS14.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠脊髓神經細胞的凋亡情況空白組及假手術組檢測到少量凋亡細胞，細胞結構清晰完整;實驗組檢測到大量凋亡細胞存在。正常神經元細胞結構清晰完整，細胞核核膜完整，細胞核染色質顆粒均勻一致;實驗組缺血再灌注6 h后，神經細胞結構不完整，核膜不完整，核仁偏移;而再灌注12 h后，脊髓神經細胞染色質固縮，并且呈斑塊狀聚集于核膜周圍，并出現透明的空泡，但神經細胞的細胞器結構尚完整; 24、48 h仍有較多凋亡神經細胞。三組大鼠各時間點細胞凋亡數量比較見表1。

表1　三組大鼠各時間點細胞凋亡數量比較(±s)

表1　三組大鼠各時間點細胞凋亡數量比較(±s)

注:與空白組及假手術組比較，*P＜0.05。

組別　細胞凋亡6 h　12 h　24 h　48 h空白組9.25±1.12　 8.56±0.04　 9.67±0.87　 6.38±1.65假手術組　9.31±1.23　 9.26±1.02　 8.23±0.59　 5.34±2.82實驗組　19.43±2.03*82.62±1.15*42.51±0.83*40.46±1.26*

2.2各組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達比較假手術組及空白組可檢測到少量表達的XBP1及磷酸化JNK蛋白。實驗組再灌注6 h后，缺血再灌注梗死灶周圍可以觀察到明顯表達的XBP1及磷酸化JNK蛋白，缺血再灌注12 h后兩種蛋白表達達到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達。詳見圖1和表2。

圖1　各組磷酸化JNK、XBP1蛋白Western blotting法檢測結果

表2　三組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達水平比較(±s)

表2　三組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達水平比較(±s)

注:與空白組及假手術組比較，*P＜0.05。

組別　　磷酸化JNK蛋白　XBP1蛋白空白組6 h　0.52±0.13　0.12±0.01 12 h　0.48±0.12　0.18±0.11 24 h　0.65±0.16　0.33±0.02 48 h　0.45±0.11　0.45±0.04假手術組6 h　0.49±0.15　0.11±0.03 12 h　0.58±0.15　0.16±0.02 24 h　0.58±0.12　0.23±0.09 48 h　0.42±0.14　0.34±0.02實驗組6 h　4.98±1.08*　3.78±1.08*12 h　9.68±3.24*　8.43±1.35*24 h　7.86±1.58*　7.14±1.12*48 h　7.45±1.56*　6.24±1.24*

3　討論

內質網應激是近年發現的介導神經細胞凋亡的

新途徑［5，6］，在應激的早期可以通過促進錯誤折疊的蛋白轉化來保護機體，因此早期的干預應激反應是治療再灌注損傷的關鍵。但繼續應激會引起相關基因轉錄水平發生變化，進一步引起某些蛋白和分子伴侶合成減少，即為未折疊蛋白反應( UPR)［7］。UPR通過內質網膜上的肌醇需求激酶1( IRE1)、PKR樣內質網激酶( PERK)、激活轉錄因子6 ( ATF6)等三個應激感受蛋白，調節未折疊或錯誤折疊蛋白［8］。這三個蛋白的信號通路可激活下游的信號分子XBP1介導的細胞凋亡。當內質網應激的反應水平低時，只能通過ATF6的蛋白水解活化來適應刺激，而當內質網應激處于高水平時，XBP1 mRNA的誘導由ATF6和IRE1共同參與，從而產生高活性的轉錄因子XBP1-S，XBP1-S進入細胞核并結合形成異源二聚體，隨后進行了一系列的反應，以減少內質網應激［9，10］。當應激刺激過強或時間過長時，XBP1-S可以進一步激活其自身的啟動子，ATF6-XBP1-S也可以通過進一步活化XBP1 mRNA的轉錄形成，失去對應激反應的處理能力，造成大量折疊蛋白的聚集，引起組織的損傷。損傷后的主要表現是神經功能的缺陷及喪失，從而引起相應的功能障礙［11］。JNK信號通路是1991年發現的一類MAPK通路。JNK最初被發現是一種特異性磷酸化核內轉錄因子C-JNK的激酶［12］。JNK MAPK信號通路存在于多種生命過程，是細胞的生長分化和死亡的關鍵路徑之一。多種信號可活化JNK途徑，如生長因子、細胞因子和細胞環境應激等［13］。當脊髓神經細胞發生內質網應激時，Ire1在內質網中被激活，激活后與GRP78分離，其次結合TRAF2和ASK1，進而形成Irel/TRAF2/ASK1復合體，進一步活化JNK通路，從而誘導神經細胞凋亡［14］?？梢?，JNK在應激反應中起著非常重要的作用，從而參與應激反應和細胞調亡。目前國內外研究已證實內質網應激參與了多種常見疾病如視網膜病變、心腦組織缺血和神經系統變性、肝炎等疾病的發病過程，在脊髓缺血再灌注損傷中也有相關的研究，但磷酸化JNK和XBPI蛋白在脊髓神經細胞應激凋亡的機制未見相關報道。

本研究結果表明，脊髓缺血再灌注損傷大鼠缺血再灌注6 h后，出現不同程度的神經細胞損傷性改變，隨再灌注時間的延長而增加，12 h達高峰，24、48 h略有下降;且脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達出現增高的趨勢，在12 h達到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達。內質網應激啟動后，早期內質網的自身保護作用發揮重要作用，此時磷酸化JNK和XBPI的表達尚低，神經細胞可適應應激反應的刺激而存活，后期內質網應激反應時間過長，內質網內未折疊蛋白聚集引起內質網功能障礙，磷酸化JNK和XBPI大量表達啟動細胞的凋亡途徑，引起脊髓神經細胞的凋亡。

可見，內質網應激參與了脊髓缺血再灌注損傷大鼠的神經細胞凋亡，其機制可能與促進脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達有關。

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收稿日期:( 2015-04-04)

通信作者:董明巖

基金項目:遼寧省科學技術計劃項目( 2013225305)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0027-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R744

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.010