不同Hoehn-Yahr分級帕金森病患者血漿a-共核蛋白的研究

陳　敏　孫　濤　陳艷紅　潘慶敏　張小喬　嚴(yán)　潔

442000　湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院干部病房(陳　敏　陳艷紅　潘慶敏　張小喬　嚴(yán)　潔)，泌尿外科[孫　濤(通信作者)]

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·論著·

不同Hoehn-Yahr分級帕金森病患者血漿a-共核蛋白的研究

陳敏孫濤陳艷紅潘慶敏張小喬嚴(yán)潔

442000湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院干部病房(陳敏陳艷紅潘慶敏張小喬嚴(yán)潔)，泌尿外科[孫濤(通信作者)]

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是神經(jīng)內(nèi)科常見退行性疾病，隨著我國老齡人口的增多，帕金森病的人數(shù)明顯增多[1]，其發(fā)病率高達(dá)1.7%，與國外發(fā)病率持平，因此帕金森病的早診斷早治療是醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的問題，而實際上出現(xiàn)臨床癥狀時多巴胺能神經(jīng)元大部分已經(jīng)變性缺失[2]，在殘存的神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)蛋白包涵體-路易體(Lewy -bodies，LBs)，它的主要組成部分就是a-共核蛋白(a-synuclein protein)，近年研究發(fā)現(xiàn)a-synuclein蛋白在血漿和腦脊液中以可溶的全長單體、可溶的中間體寡聚物(oligomeric)、不溶的多聚體三種形式存在，三者的聚集狀態(tài)及相互平衡與PD的病程有密切的聯(lián)系[3]。進(jìn)一步的研究證明對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的主要是可溶性的a-synuclein蛋白中間體寡聚物，而并非不溶的a-共核蛋白多聚體。相當(dāng)多的證據(jù)表明a-synuclein蛋白寡聚體有細(xì)胞毒性作用[4]。由此可見血漿中a-synuclein蛋白全長和寡聚體水平與帕金森病有直接相關(guān)性，本實驗通過檢測十堰地區(qū)帕金森病患者與對照組血漿a-synuclein蛋白全長及寡聚體水平差異，同時對不同疾病分期的PD患者進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定a-synuclein蛋白與帕金森病的關(guān)系，從而為帕金森病的診斷尋求一個生物標(biāo)志物，協(xié)助帕金森病的疾病分期、診斷、治療。

1材料與方法

1.1實驗材料和病例資料

1.1.1主要試劑及儀器人血漿a-synuclein蛋白全長及寡聚體ELISA試劑盒購自上海藍(lán)基生物公司(上海，中國)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，USA)，自動洗板機(jī)(MODEL1575，USA)，臺式高速離心機(jī)(TGL-16G，中國)。

1.1.2病例資料選擇2012年9月-2015年1月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)科及老年病科就診的患者，原發(fā)性帕金森病組共48例，配對選擇同時間段體檢健康者作為對照組(表1)。

表1　2組患者基本資料比較

1.1.3納入標(biāo)準(zhǔn)PD診斷參照英國Brain Bank[5]的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(具備下列3條以上可診斷為臨床肯定的帕金森病):(1)單側(cè)起病；(2)存在靜止性震顫；(3)病程呈進(jìn)行性；(4)不對稱性特征持續(xù)存在，起病側(cè)受累更重；(5)左旋多巴反應(yīng)良好；(6)嚴(yán)重的左旋多巴所致的舞蹈動作，左旋多巴療效持續(xù)5年以上；(7)臨床病程10年以上。所有患者均由同一位醫(yī)生間斷3次評估，無家族遺傳病史，均經(jīng)頭顱CT或MRI檢查未見明顯異常。

1.1.4排除標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)帕金森綜合征；(2)帕金森疊加綜合征；(3)起病前服用過抗精神病藥物、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)暴露史、重金屬中毒史；(4)大劑量左旋多巴治療無效(除外吸收不良)；(5)家族遺傳病史。

1.1.5帕金森病Hoehn-Yahr分級[6]：I期：單側(cè)身體受影響，功能減退很小或沒有減退；II期：身體雙側(cè)或中線受影響，但沒有平衡功能障礙；III期：受損害的第一個癥狀是直立位反射，當(dāng)轉(zhuǎn)動身體時出現(xiàn)明顯的站立不穩(wěn)或當(dāng)患者于兩腳并立，身體被推動時不能保持平衡。功能方面，患者的活動稍受影響，有某些工作能力的損害，但患者能完全過獨(dú)立生活；IV期：嚴(yán)重的無活動能力，但患者仍可自己走路和站立；V期：除非得到幫助只能臥床或坐輪椅。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集收集PD患者及對照組外周靜脈血10 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，高速離心機(jī)3000 r/min，離心20分鐘，分離上層血漿，下層血清分裝后置于-80℃冰箱待檢測，全部樣本同批測定。

1.2.2a-synuclein水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)中的競爭免疫分析法進(jìn)行檢測，試劑盒購自上海藍(lán)基生物公司。

1.2.2.1拿出試劑盒，在室溫(20～25℃)下放置15～30 min。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100 μl 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。

1.2.2.3待測樣品檢測加待測樣品→加酶標(biāo)物→溫育→洗滌→加底物→溫育→加終止液。空白微孔中加入100 μL的樣品，空白對照加入100 μL的蒸餾水；在各孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液，(不含空白對照孔)；將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng)1 h；(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)；酶標(biāo)板在自動洗板機(jī)中洗滌約10 min(濃縮洗滌液以1∶100 的比例與蒸餾水稀釋)；各孔加入顯色劑A、B 液各50 μL(不含空白對照孔)；20～25℃下避光反應(yīng)15 min；各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。

1.2.2.4比色→判斷：30 min內(nèi)在波長450 nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD 值；使用logit-log 或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式，由電腦自動計算得出。

2結(jié)果

2.12組血漿a-synuclein蛋白水平比較

PD組血漿a-synuclein蛋白單體的水平，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)；PD組與正常組血漿中a-synuclein蛋白寡聚體水平比較， PD組(3.869±1.292 ng/mL)高于對照組(2.922±0.804 ng/mL)(P<0.05)(表2)。

表2　PD組與對照組血漿a-synuclein蛋白水平比較

注：&48例PD患者檢測寡聚體水平時，其中有2例患者因其OD值小于檢測范圍，相應(yīng)其水平超過檢測范圍(10 ng/mL)，因無具體數(shù)值，故未納入比較；與對照組比較，P<0.05

2.2PD患者不同Hoehn-Yahr分級血漿a-synuclein蛋白水平比較

PD患者根據(jù)Hoehn-Yahr分級分組， a-synuclein全長水平比較，不同分期均無明顯差異；寡聚體水平比較，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期均有差異，且隨著疾病嚴(yán)重，其水平呈上升趨勢(表3)。

表3　不同疾病分期PD組血漿a-synuclein全長及

注：與PD組Ⅱ期比較，△P<0.05;與PD組Ⅲ期比較，*P<0.05

3討論

帕金森病是老年人群中多發(fā)的運(yùn)動障礙性疾病，我國的發(fā)病率及患病率逐年增加，該病進(jìn)展過程中嚴(yán)重影響了患者的生活及工作能力，藥物治療效果有效，因此成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點。

PD的主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性、死亡以及在殘存的神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)嗜酸性的淀粉樣蛋白包涵體-路易體(Lewy -bodies，LBs)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LBs主要是由一些中空的放射性淀粉樣纖維a-syn-uclein蛋白組成，a-synuclein蛋白聚集是PD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究若能明確血漿a-synuclein蛋白全長或者寡聚體與散發(fā)性帕金森病相關(guān)性，那么a-synuclein蛋白可以作為有希望的生物學(xué)指標(biāo)，協(xié)助帕金森病的診斷、治療、預(yù)防。

a-synuclein蛋白在皮層、海馬、黑質(zhì)神經(jīng)元及非神經(jīng)細(xì)胞如肌肉、脾、血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是a-synuclein蛋白的主要來源，并且神經(jīng)細(xì)胞釋放a-synuclein蛋白到腦脊液及血漿。Chi等發(fā)現(xiàn)PD患者與正常人外周組織a-synuclein蛋白mRNA的表達(dá)并無不同，表明PD患者外周組織液中a-synuclein蛋白水平的升高是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化反映在外周組織中所致[7]。最近湘雅二醫(yī)院運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測154例散發(fā)PD血漿a-synuclein蛋白水平，結(jié)果提示不同病程、年齡、疾病分期血漿中a-synuclein蛋白水平無明顯差異。但也有結(jié)果相反的實驗報道，2007年第11屆國際帕金森病和運(yùn)動障礙大會上Neumayer等報道125例PD患者血漿a-synuclein蛋白的水平為(10.3±22.6)ng/mL，50名正常人為(29.4±11.6)ng/mL。所以，認(rèn)為PD患者血中a-synuclein蛋白水平下降。

不同的學(xué)者所測血漿a-synuclein蛋白水平存在較大差異，考慮與所檢測a-共核蛋白聚集狀態(tài)不同及民族遺傳背景不同有關(guān)，本研究為避免此情況出現(xiàn)，檢測對象均為漢族，a-synuclein蛋白水平檢測分全長及寡聚體兩部分。本研究結(jié)果提示帕金森病患者血漿中a-synuclein蛋白寡聚體水平與正常組比較有明顯差異，PD組寡聚體水平(3.869±1.292 ng/mL)高于對照組(2.922±0.804 ng/mL)。這個結(jié)果和Lee結(jié)果一致。Omar等在血漿中檢測到a-synuclein蛋白寡聚體，且呈輕度升高的水平，但與正常人群比較差異不顯著[8]。Lee等人認(rèn)為a-synuclein蛋白的中間體寡聚體的聚集可能是由a-synuclein蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中的一個重要進(jìn)程，并且通過實驗證明了a-synuclein蛋白的中間體寡聚物的清除是通過溶酶體降解途徑完成的[9]。Cole提出凡能作用a-synuclein蛋白解聚的外源或內(nèi)源因子都能對PD產(chǎn)生影響[10]。a-synuclein蛋白的積聚不僅具有神經(jīng)毒性作用，對突觸功能和信號傳遞也有影響，參與PD的發(fā)病和發(fā)展過程[11]。outeiro提出小分子寡聚體的形成的治療策略將加快PD藥物的發(fā)展[12]。因此，研究a-synuclein蛋白中間體寡聚物與PD的關(guān)系就顯得更有意義。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗競爭法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)十堰地區(qū)48例散發(fā)性帕金森病患者血漿中a-synuclein蛋白單體水平與對照組比較無顯著差異，但寡聚體水平明顯高于對照組，且帕金森患者Hoehn-Yahr分期越高，活動障礙越嚴(yán)重，血漿a-synuclein蛋白寡聚體水平越高(P<0.05)。因此，血漿a-synuclein蛋白寡聚體可作為帕金森病診斷的有潛力的生物標(biāo)志物，為協(xié)助帕金森病診斷及疾病分期提供幫助，為建立中國人群的帕金森病的血液診斷指標(biāo)及疾病分期打下堅實的基礎(chǔ)。

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(2015-03-19收稿2015-05-12修回)

【摘要】目的檢測十堰地區(qū)不同Hoehn-Yahr分級的散發(fā)性帕金森病患者血漿a-共核蛋白水平的差異。方法選擇2012年9月-2015年1月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院就診的48例原發(fā)性帕金森病患者，參照Hoehn-Yahr分級標(biāo)準(zhǔn)分組，對照組選擇年齡、性別均與病例組匹配的健康人。采用ELISA方法檢測比較48例帕金森病患者與48例正常對照組以及不同Hoehn-Yahr分級PD患者血漿中a-synuclein蛋白寡聚體水平的差異。結(jié)果十堰地區(qū)48例散發(fā)性帕金森病患者血漿中a-synuclein蛋白單體水平與對照組相比無顯著差異，PD組寡聚體水平(3.869±1.292 ng/mL)與對照組(2.922±0.804 ng/mL)比較有顯著差異，且不同Hoehn-Yahr分級的PD患者血漿a-synuclein蛋白寡聚體水平比較有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論在十堰市我們首次開展了散發(fā)性帕金森病患者血漿a-synuclein寡聚體水平高于正常人,且隨著疾病嚴(yán)重及分期的進(jìn)展，其水平呈上升趨勢。因此，血漿a-synuclein蛋白寡聚體可作為帕金森病診斷的有潛力的生物標(biāo)志物，為協(xié)助帕金森病診斷及疾病分期提供幫助。

【關(guān)鍵詞】帕金森病血漿a-共核蛋白寡聚體

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.06.001

Study of plasma α-synuclein oligomers in different Hoehn-Yahr classification Parkinson patientsChenMin,SunTao,ChenYanhong,etal.CadresWard,TaiheHospital,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000

【Abstract】ObjectiveTo explore the plasma α-synuclein concentration in different Hoehn-Yahr grade of sporadic Parkinson's disease patients in Shiyan, further to determine the relationship between plasm α-synuclein protein and grade of Parkinson's disease. Methods48 cases of idiopathic Parkinson's patients which were from Hubei Medical College Affiliated Taihe Hospital from September 2012 to January 2015 were grouped as Hoehn-Yahr classification standard reference group. The control group were matched with healthy people. ELISA was used to detect α-synuclein protein oligomers concentration. Resultsα-synuclein protein monomer concentration was compared between the control group and PD group. α-synuclein protein monomer concentration of PD group is (3.869±1.292 ng/mL), as well (2.922±0.804 ng/mL) of control group. There was significant difference (P<0.05) between the two groups. ConclusionsParkinson's disease was found has the higher plasma concentration of α-synuclein oligomers than normal. As the disease progress serious and staging, its concentration rises. Therefore, plasma α-synuclein protein oligomers can be used as diagnosis of Parkinson's disease has the potential biomarkers for the diagnosis of Parkinson's disease and help to distinguish the disease stage.

【Key words】Parkinson's diseasePlasmaα-synuclein oligomer

【中圖分類號】R742.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)06-0323-04

基金項目：湖北省教育廳科學(xué)研究計劃指導(dǎo)項目(B2015473)