硅藻18S　rRNA鑒別實驗家兔水中尸體死因的研究

周玉倩

工作單位：210042江蘇省南京市東南司法鑒定中心

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硅藻18SrRNA鑒別實驗家兔水中尸體死因的研究

周玉倩

工作單位：210042江蘇省南京市東南司法鑒定中心

【摘要】目的 利用硅藻18S rRNA基因檢測判定實驗家兔水中尸體的死亡原因。方法 將實驗家兔隨機分成溺死組（n=12）、死后拋尸入水組（n=12）及空白對照組（n=6）。各組按實驗設計分別提取死后家兔的肺、肝、腎、腦組織和心血，勻漿后，選用硅膠密度梯度離心法分離組織中的硅藻并采用Chelex-100法提取硅藻DNA，運用PCR技術擴增硅藻特異的18S rRNA基因片段。結果 溺死組肺、肝、腎、腦組織及心血中硅藻檢測多數呈陽性：肺（100%）、肝（75%）、腎（83%）、腦（66.7%）、心血（58.3%）；死后拋尸入水組僅在肺組織和腎組織中各檢出2例和1例陽性；空白對照組各組織全部呈陰性。結論 將PCR技術擴增硅藻18S rRNA基因片段運用到家兔水中尸體的死亡原因判斷，其靈敏度和特異性均優于傳統的硅藻強酸消化法。此檢測方法對水中尸體的死因鑒定具有一定的應用前景。

【關鍵詞】硅藻18S rRNA；PCR擴增；水中死亡；死因鑒定

溺死（death by drowning）是由于液體機械性的阻塞呼吸道及肺泡，阻礙氣體交換，導致體內缺氧、二氧化碳潴留，而發生的窒息性死亡［1］。水中尸體的死因鑒定一直是法醫鑒定中的熱點亦難點之一。法醫學實踐中硅藻檢驗法仍是目前鑒定水中尸體死因相對可靠且最為常用的診斷方法［2-3］。隨著分子生物學的發展，部分學者嘗試通過擴增浮游生物DNA序列的方法檢測硅藻，并將其用于水中尸體的死因鑒定［4-7］。本文嘗試通過PCR擴增得到硅藻18S rRNA片段，并研究硅藻18S rRNA在水中尸體死因鑒定中的應用價值。

1　材料與方法

1.1實驗分組和動物模型制作

大白兔30只隨機分成三組，分別為溺死組（n=12）、死后拋尸入水組（n=12）和空白對照組（n=6）。將溺死組實驗動物置于籠中鎖緊并系上長繩，沉入江水約0.5 m深處，停留1 min后提出水面，30 s后重新沉入相同深度水中，重復該步驟2～3次后，將家兔沉入水中直至溺死，在水中浸泡5 h后取出；將死后拋尸入水組實驗動物以鈍性閉合性腦外傷處死后，尸體置于籠中鎖緊并系上長繩沉入溺死組相同深度同水域，浸泡5 h后取出。對照組則將實驗動物以鈍性閉合性腦外傷處死后不做任何處理。同時收集溺死地點相同水深處的水樣各15 ml編號放入Ep管內。

1.2檢材制備

在處理實驗動物之前，先將實驗所需全部器械用超純水沖洗浸泡。將各組實驗動物尸體用單蒸水反復沖洗后，移至超凈工作臺上，打開胸腹腔后用一次性注射器從左心抽取心血并轉移至干凈的Ep管中。用超純水反復沖洗各內臟表面后提取肺、肝、腎組織，最后打開顱腔提取腦組織，亦用超純水沖洗表面。取肺、肝、腎、腦組織各2 g放入已經超純水沖洗浸泡的玻璃勻漿器內，加入少量超純水后進行充分勻漿，將勻漿好的組織液倒入潔凈的Ep管中。

1.3硅藻的分離及提DNA提取

根據何方剛等［6］報道的方法，將肺、肝、腎、腦組織的組織勻漿液及心血各5 ml分別轉移至20 ml離心管（BECKMAN，American）中，各加入8 ml Percoll?溶液（Aersham Biosciences，Sweden）并充分混勻，配平后對稱放入高效離心機（BECKMAN，American）內，12℃ 17000 rpm離心60 min。棄上清并向下層液體中加入2倍體積超純水，充分混勻后12℃ 6000 rpm 離心15 min。棄上清并向下層沉渣中加入10 ml超純水，充分混勻后12℃ 12000 rpm離心10 min。棄上清保留沉渣。取水樣2 ml，12000 rpm條件下離心10 min，棄上清并向沉淀內加入等體積超純水，充分震蕩后12000 rpm離心5 min，棄上清保留沉渣。向各組織及水樣沉渣中分別加入200 μl 10% Chelex-100溶液，﹣80℃冰凍30 min，取出后立即放入56℃水浴鍋中解凍，5 min后從水浴鍋中取出，再次放入﹣80℃冰箱中冰凍30 min，重復凍融3次后按常規Chelex-100法提取硅藻DNA。

1.4PCR擴增及產物檢測

采用J Zimmermann［8］等報道的引物擴增硅藻18S rRNA，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　擴增硅藻18S rRNA的引物序列

PCR反應總體系為25 μl，內含200 μmol/L dNTPs溶液2 μl，10×buffer緩沖液2.5 μl （包含100 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl（pH8.3）），5 U/μl Taq?DNA聚合酶1.25 μl（以上產品均由日本Takara Bio株式會社提供），上、下游引物各0.5 μl（濃度均為20 μmol/L），模板DNA 4 μl ，以及滅菌蒸餾水14.25 μl。PCR循環參數為：94℃ 2 min，然后94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，共40個循環，再72℃延伸10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙錠顯色。

1.5強酸消化法

分別取用肺、肝、腎被膜下組織10～20 g，使用常規強酸消化法制得沉渣懸液后封片鏡檢。

2　結果

2.1硅藻18S rRNA檢測結果

引物對D512for 18S和D978rev 18S擴增的產物大小約為400 bp,瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。溺死組大多數動物內臟組織均檢測出硅藻18S rRNA擴增產物；死后拋尸入水組僅在肺組織和腎組織中各檢出1例陽性；對照組各組織均無擴增產物，各組具體結果見表2。

2.2強酸消化法硅藻檢測結果

溺水地點所取水樣中主要含有的藻類有直鏈藻、舟形藻、針桿藻、曲殼藻，以及小環藻、菱形藻、布紋藻卵形藻等，硅藻大小7 μm～1 mm不等。

溺死組肺組織中含有溺死點水樣中的大多數種類的硅藻，如直鏈藻、舟型藻、針桿藻、曲殼藻等，硅藻大小多為10～20 μm；肝和腎組織中所見的硅藻種類很少（1～3種），如針桿藻、舟型藻等。各組中肺、肝、腎組織的硅藻檢測結果見表3。

表2　各組18S rRNA 產物的陽性數和陽性率

表3　各組織強酸消化法硅藻檢驗陽性數和陽性率

3　討論

3.1硅藻18S rRNA PCR檢測在溺死鑒定中的應用價值

本文選擇J Zimmermann設計的引物，其擴增產物所含多態性信息豐度較高，利于硅藻種群分析。本實驗中，從溺死地點所取得的水樣均檢出硅藻，而以雙蒸水為樣本的陰性控制對照無擴增產物（圖1）。表明通過檢測硅藻18S rRNA基因片段進行溺死鑒定在方法學上是可靠的。本研究溺死組12例中肺組織全部檢出硅藻18S rRNA基因片段（100%）。肝和腎組織中檢測的陽性率分別為75%和83%，而強酸消化法的陽性率則分別為25%和16.7%，對兩兩進行檢出率卡方檢驗結果顯示：肝組織中兩種硅藻檢驗方法具有統計學意義（0.01＜P＜0.05）;腎組織中兩種方法具有高度統計學意義（0.001＜P＜0.01）。同時，硅藻18S rRNA在腦組織和心血中的檢出率分別為66.7%和58.3% 。單從檢出率看，本實驗中肺、肝和腎組織的檢出率略高于以往報道的硅藻檢出率（肺96%、肝78%、腎67%）［9］；而腦組織和心血的檢出率相對于傳統的硅藻檢驗而言，呈明顯提高。且實驗運用PCR技術檢測溺死尸體組織中的硅藻18S rRNA序列，其靈敏度要遠高于傳統硅藻檢驗法。本實驗中，取2 g動物組織或2 ml心血進行檢測，即可得到明確的陽性結果，而傳統的硅藻檢驗一般需約20 g以上的組織。本實驗中心血的硅藻陽性檢出率相較于其他組織而言則相對偏低，可能是由于溺死后并經過長時間浸泡的家兔心血凝固現象明顯，可獲得的心臟內血液量很少，故導致其檢出率相對較低。

3.2強酸消化法在硅藻檢測中的應用價值

使用強酸消化法進行硅藻檢驗，能夠直觀的從形態學上對藻類進行數量分析和種類鑒別，并借助硅藻豐度、Kater分離值、種群指數和優勢指數等指標進行分析，幫助推斷溺水地點。應用本實驗中的PCR方法雖可以極大提高硅藻檢測靈敏度，但無法確定藻類數量及進行硅藻種類的比對。

圖1　溺死組（A）和對照組（B）不同組織硅藻18S rRNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果M：50 bp DNA Ladder；1：溺死點水樣；2～6：肺、肝、腎、腦組織和心血；7：陰性對照

參考文獻

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A Study on Detecting Diatom 18S rRNA Genes to Identify Cause of Death by Drowning on Rabbits

ZHOU YuqianNanjing Southeast Forensic Service in Jiangsu province，Nanjing 210042，China

【Abstract】

Objective To evaluate the value of detecting the diatom 18S rRNA genes in the identification of drowning death in rabbits.Methods The experimental rabbits were randomly divided into groups drowning （n = 12），after the death of the dead bodies into the water group （n = 12）and control group （n = 6）.Each group according to the experimental design were extracted after death rabbit lung，liver，kidney，brain and effort，homogenized，use silica density gradient centrifugation organization diatoms and extracted using Chelex-100 diatom DNA，PCR amplified using diatom-specific 18S rRNA gene fragment.Results For drowning group，the specific amplification products of 18S rRNA gene were detected from most kinds of tissues from drowning group ：lung （100%），liver （75%），kidney （83%），brain （66.7%）and heart blood （58.3%）.For postmortem submersion group，however，only two cases were detected from lung tissues and one case was detected from kidney tissues respectively.No amplified products were positive in various tissues in control group.Conclusion The detection rate of the 18S rRNA gene with PCR-based method developed by this study was higher than the traditional method of diatom with strong acid digestion method in drowning victims.Both of the sensitivity and specificity of this method were superior to traditional methods，and it can be used as a potentially useful tool to identify cause of death by drowning.

【Keywords】Diatom 18S rRNA，PCR，Death by Drowning，Identify Cause of Death

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.12.018

【中圖分類號】D919.4

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2015）12-0023-03