基于IFCC參考測量程序實現常規檢測系統量值溯源的可行性探索

基于IFCC參考測量程序實現常規檢測系統量值溯源的可行性探索

鄧擁軍1，石英1，周俊2，吳立山2，沈敏2

(1. 湖北省中醫院檢驗科，湖北 武漢 430074；

2. 寧波美康生物科技股份有限公司參考實驗室，浙江 寧波 315104)

摘要：目的探討基于國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(IFCC)參考測量程序對常規檢測系統實現量值溯源的可行性分析。方法以乳酸脫氫酶(LDH)為例，采用IFCC參考測量程序和常規檢測系統(以下簡稱A法)同時測定20份不同濃度冷凍人混合血清樣本。按《臨床檢驗質量管理技術基礎》中判定依據和偏移圖分析法進行評價常規檢測系統測量結果的正確度，對存在系統偏移的常規方法通過回歸分析進行廠家校準品認定值校正，并測定20份不同濃度的新鮮單人份血清驗證校正后該方法(以下簡稱B法)測量結果的正確性。結果A法與IFCC參考測量程序測定結果的直線回歸方程為Y=1.092X-4.529，平均偏移為7.24%，B法校準品校正值為174 U/L。經驗證B法與IFCC參考測量程序測定結果的直線回歸方程為Y=0.988X-0.470，平均偏移降為-1.37%。結論A法測量結果明顯偏高于參考測量程序測量結果，經校正建立的B法與參考測量程序測定結果一致。

關鍵詞：乳酸脫氫酶；常規方法；參考測量程序

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-1039-05Q554

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.018

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility for metrological traceability of conventional determination system based on the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine(IFCC)reference measurement procedure. MethodsThe 20 frozen serum samples with different concentrations were determined for lactate dehydrogenase(LDH)according to IFCC reference measurement procedure and routine method (as A method). The accuracy was evaluated according to the guideline of the Basic Quality Management Practice in Clinical Laboratory and the offset graph graphical-analysis. If the routine method existed bias， the calibration value was corrected by regression analysis. The fresh single serum samples of LDH were determined simultaneously by IFCC reference measurement procedure and routine method (as B method) in order to verify the accuracy measured by A method. ResultsThe regression equation with A method and IFCC reference measurement procedure was Y=1.092X-4.529， and the average bias value was 7.24%. B method calibrators′ correction value was 174 U/L. The regression equation with B method and IFCC reference measurement procedure was Y=0.988X-0.470， and the average bias value was -1.37%. ConclusionsThe results of A method are significantly higher than those of IFCC reference measurement procedure， and the results of B method established through amendments are consistent with those of IFCC reference measurement procedure.

作者簡介：鄧擁軍，1970年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床化學檢驗工作。

收稿日期：(2014-11-08)

Investigation on the feasibility for metrological traceability of conventional determination system based on IFCC reference measurement procedureDENGYongjun1,SHIYing1,ZHOUJun2,WULishan2,SHENMin2.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiHospitalofTraditionalChineseMedicine,HubeiWuhan430074,China; 2.ReferenceLaboratory,NingboMedicalSystemBiotechnologyCo.,Ltd.,ZhejiangNingbo315104,China)

Key words: Lactate dehydrogenase；Routine method；Reference measurement procedure

血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是臨床實驗室檢測頻率極高的項目之一，是心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤等疾病診斷、治療監測的重要指標。既往研究表明血清LDH常規方法測定結果各實驗室之間缺乏可比性[1-2]，已影響臨床診斷和治療。根據ISO15189要求[3]，各實驗室測定結果應準確并可溯源。按ISO18153文件要求[4]，血清LDH測定結果應溯源至國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)參考測量程序[5]。在我國，臨床實驗室多采用自動生化分析儀的常規方法測定血清LDH活性，這類方法測定結果的正確度與校準品直接相關[6-8]。

我們采用廠家校準品認定值校準的常規方法與IFCC參考測量程序2種模式同時測定20份不同濃度冷凍人混合血清樣本，判定常規方法測定結果的正確性。對存在系統偏倚的常規方法通過回歸分析進行廠家校準品認定值校正，并采用20份不同濃度的新鮮單人份血清驗證校正后該方法測定結果的正確度。

材料和方法

一、材料

1. 儀器(1)參考測量程序儀器：UV-2450 紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)、1523型點溫度計(美國FLUKE公司)、XS205DU型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、SevenMulti型pH計(瑞士METTLER TOLEDO公司)、移液器(德國Eppendorf AG公司)，所用儀器均通過相關部門鑒定或參考實驗室內部文件校準；(2)常規檢測方法儀器：雅培C-8000全自動生化分析儀(美國雅培公司)。

2 .試劑(1)參考測量程序試劑：NAD鋰鹽(95%)、N-甲基-D-葡萄糖胺(99%)、β-NAD游離酸(98%)、L-乳酸、鋰鹽(99.7%)、氯化鈉(99.5%)，均購自美國Sigma公司；(2)常規方法試劑：試劑為寧波美康生物科技股份有限公司(簡稱美康生物)生產的LDH試劑盒。

3. 參考物質、質控品、校準品(1)參考物質：參考測量程序準確性評價用參考物質為有證參考物質ERM-AD453[批號為000931，認定值±不確定度為(502±7)U/L]；(2)質控品：參考測量程序精密度評價用質控品為C.f.a.s(Roche公司)；(3)校準品：常規方法的校準品由美康生物提供，A法的校準品由美康生物初步定值(191.52 U/L)；B法的校準品由美康生物參考實驗室最終定值(174.0 U/L)，可以溯源到ERM-AD453。按說明書規定復溶和使用ERM-AD453、質控品、常規方法校準品。

4. 血清樣品的制備收集湖北省中醫院非傳染性疾病患者血清20份，血清LDH濃度范圍為109～500 U/L，制備成20份不同濃度人血清樣本，冷凍于-70 ℃保存。使用前從-70 ℃取出，室溫融解后使用；常規方法偏倚校正效果驗證使用的血清樣本為檢測當天收集的20份不同濃度的新鮮單人份血清。

二、方法

1. 參考測量程序測定美康生物參考實驗室按照IFCC參考測量程序[5]第3部分準備實驗條件，用參考物質ERM-AD453驗證參考測量程序測定結果正確度，要求：3次測定結果在“認定值±不確定度”范圍內。該室自建立IFCC參考測量程序后每年都通過參加國際室間比對實驗來維持測定結果的正確度(IFCC-RELA能力驗證，具體見http：//www.dgkl-rfb.de：81/；美康生物參考實驗室為87號實驗室)。用C.f.a.s質控品驗證參考測量程序的精密度，要求：樣本每天測定5次，連續測定2 d，10次測定的變異系數(CV)<1%。在參考測量程序測量的正確度和精密度達到要求后進行20份不同濃度冷凍人混合血清樣本測定。測定順序為質控品→樣本→質控品，每個樣本重復測定2次，其均值作為評價數據，每10份血清加測一個質控品。

2. 常規方法(A法)測量的正確性評價實驗方法常規方法測量系統由美康生物校準品、試劑、試劑配套參數及雅培C-8000全自動生化分析儀組成，嚴格按照廠家說明書規定進行20份不同濃度冷凍人混合血清樣本的LDH測量，測定順序為質控品→樣本→質控品，每個樣本重復測定2次，其均值作為評價數據[9]。

3. 常規方法測量的系統偏倚校正效果驗證實驗在雅培C-8000全自動生化分析儀的2個測量通道上分別以美康生物校準品的認定值、校正值作為校準值校準常規方法，同時測量20份不同濃度的新鮮單人份血清。測定順序為質控品→樣本→質控品，每個樣本重復測定2次，以均值作為評價數據。按EP9-A2文件方法判斷數據的有效性[10]。驗證校正后的方法稱B法。

三、統計學方法

采用Origin 8.0軟件進行統計分析。以IFCC參考測量程序作為比較方法，廠家常規方法為待評價方法，進行回歸分析和常規方法的正確度判定。常規方法的正確性依據回歸方程斜率(k)=1.00±0.02、截距接近于0、設定偏移值(國際參考實驗室室間質量評價LDH的合格標準為4.5%)進行判斷[11]。對存在系統偏移的常規方法校正后測量結果的正確度，以IFCC參考測量程序作為比較方法，校正后的常規方法為待評方法(B法)，采用同樣模式進行正確性評價。

結果

一、 測定數據的有效性檢驗

本研究所有數據經檢驗無離群值。

二、IFCC參考測量程序測定性能評定

ERM-AD453的檢測結果在“認定值±不確定度”范圍內，用C.f.a.s樣本驗證參考測量程序的精密度，CV<1%，見表1。符合IFCC參考測量程序檢測的性能要求。

表1　IFCC參考測量程序性能

三、常規方法測量的正確性評價實驗結果

用經性能評定合格的參考測量程序和廠家常規系統同時測量20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，以IFCC參考測量程序為比較方法，廠家測量系統(校準品認定值定標，A法)作為待評方法，依據《臨床檢驗質量管理技術基礎》[11]的判定依據和偏移圖圖形分析法進行回歸分析評價。結果發現常規測量系統與IFCC參考測量程序測量結果存在系統偏差，其測量結果明顯偏高，A法與參考測量程序的平均偏移為7.24%，見圖1、圖2。根據回歸方程，調整校準品的認定值，校正后該方法校準品值為174.0 U/L。用修訂常規系統 (B法)和參考測量程序再次同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，發現修訂常規系統和參考測量程序測量結果一致，B法與參考測量程序的平均偏移為-1.37%，見圖3、圖4。

圖1　A法與IFCC參考測量程序測定結果比較

圖2　B法與IFCC參考測量程序測定結果比較

圖3　A法與IFCC參考測定程序測定結果的偏移

圖4　B法與IFCC參考測定程序測定結果的偏移

四、常規方法測量的系統偏倚校正效果驗證結果

以廠家常規方法A校準品校正值替代認定值建立B方法，用B方法和參考測量程序同時測量20份不同濃度的新鮮單人份血清，以驗證其校正效果。校正后的相關方程為Y=0.988X-0.470，R2=0.998 5，依據回歸方程的k在1.00±0.02范圍內[11]、設定偏移值(國際參考實驗室時間質量評價LDH合格標準4.5%)評價標準，B法測定結果正確，見圖5。

圖5　B法與IFCC參考測量程序校驗結果比較及偏移圖

討論

常規檢測系統包括儀器、試劑、校準品和操作程序，使用自動化分析儀日常檢驗的精密度得到了顯著的提高；在優良試劑盒的配合下，結果可靠性的關鍵是準確度。在常規檢測系統儀器、試劑和操作程序一定的情況下，決定新鮮患者標本測定結果準確性的關鍵因素是校準品值。本研究通過常規方法與參考測量程序進行方法學比對調節校準品值，實現臨床樣本測定結果的準確性，繼而達到溯源的目的，這也是校準的意義所在。

目前，絕大多數臨床實驗室使用的是商品試劑盒或分析系統。因此，廠家產品校準品定值的溯源性顯得尤為重要，歐盟體外診斷器具指令提出的溯源性要求和ISO17511及ISO18153都是針對診斷器具生產廠家。要實現臨床檢驗量值溯源性，解決常規方法測量結果量值溯源問題[12-14]，就是要建立并應用參考系統，參考系統通常包括參考物質、參考方法和參考實驗室。由于參考系統工作對設施設備、人員技術等方面要求較高，操作繁瑣，價格昂貴，而且要維持其成本很高。所以，參考實驗室工作應該由少數有能力、有實力的優秀實驗室來實施，一般常規檢測實驗室沒有能力對檢測方法進行所謂的“溯源性校正”。“溯源性校正”主要由體外診斷器具生產廠商進行。

本研究是美康生物參考實驗室在建立LDH參考系統的基礎上，采用IFCC參考測量程序評價常規方法測量結果的正確度。對存在系統偏倚的A方法的校準品重新賦值，建立校正后廠家常規方法(B法)與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本。

用參考測量程序和廠家常規系統同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，常規檢測系統(A法)與參考測量程序測定結果線性回歸方程為Y=1.092X-4.529，R2=0.999，平均偏移為7.24%。以《臨床檢驗質量管理技術基礎》[11]中2種方法的線性回歸方程的k=1.00±0.02、截距≈0作為一致性的標準，再結合偏移圖圖形分析法(以參考測量程序測定結果為橫坐標，常規方法測定均值與參考測量程序測定結果的偏移程度為縱坐標作圖)進行回歸分析評價。以常規方法與參考測量程序的平均偏移≤±4.5%為標準(IFCC允許偏移范圍)判斷常規方法的正確度。A法與IFCC參考測量程序測定結果存在系統偏差，其測定結果明顯偏高(偏移為7.24%)。對存在系統偏移的A法的校準品重新賦值(174 U/L)，建立校正后廠家常規方法(B法)，并與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，B法與參考測量程序測定結果線性回歸方程為Y=0.991 6X-0.871 0，R2為0.998 22，平均偏移降為-1.37%。結果表明A法校正后可實現測定結果正確。為了驗證常規方法測定的系統偏移校正效果，采用B法與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的新鮮單人份血清，測定結果線性回歸方程為Y=0.988X-0.470，R2=0.998 5，平均偏倚為-1.37%。結果進一步驗證說明了A法校正后可實現測定結果正確。

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(本文編輯：龔曉霖)